单克隆抗体（MAb）是生物制剂发展的重点。许多最畅销的药物是治疗用单克隆抗体或相关蛋白。到2020年，单克隆抗体的全球总销售额将接近1250亿美元。在美国或欧洲，已经批准了大约50种可治疗多种疾病的单抗产品。随着大量单克隆抗体的不断发现和研究的深入发展，生物制药企业需要加快工艺开发并将项目快速转移到临床生产中。制剂开发是产品开发的重要方面，通常是成功进行临床生产和稳定性研究的关键之路，这也对新药申报（IND）的研究备案至关重要。于是利用平台流程缩短工艺开发时间和节省资源的讨论经常主要集中在上游和下游纯化操作中。在这里，我们描述了成功用于单克隆抗体制剂开发的快速平台策略。
一、商业化单抗配方概述
通过研究商业化单抗产品，我们为成功的单抗配方建立了丰富的数据库。尽管每种抗体都是唯一的，但单抗分子在结构上高度相似。从成功的例子中学到的经验对于开发稳定有效的新单克隆抗体制剂非常有价值。
我们总结了37种已成功用于商业单抗的制剂，包括片段抗原结合（Fab）和抗体药物偶联物（ADC）。其中，冻干制剂为12种，液体制剂为25种，浓度范围为2mg/mL至200mg/mL。下表1列出了这些单克隆抗体制剂中使用的赋形剂。可以观察到一些共同点：
1、我们发现了六类赋形剂：缓冲剂、盐、表面活性剂、多元醇/二糖/多糖、氨基酸和抗氧化剂。
2、六种常用的缓冲剂将pH值保持在4.7至7.4之间：乙酸盐、柠檬酸盐、组氨酸、琥珀酸盐、磷酸盐和羟甲基氨基甲烷（Tris）。组氨酸和磷酸盐占主导地位（分别以35％和33％的配方使用）。
3、大多数（80％）配方使用三种表面活性剂之一：聚山梨酯80（吐温80）、聚山梨酯20（吐温20）和泊洛沙姆188（(Poloxamer）。其中72％使用聚山梨酯80。
4、所有冻干（冷冻干燥）制剂使用多元醇/二糖/多糖（例如，甘露醇、山梨糖醇、蔗糖、海藻糖和右旋糖酐40）中的一种或几种混合物。蔗糖是最受欢迎的赋形剂，这些制剂中80％以上都包含蔗糖。糖为冻干制剂提供了体积支撑，并用作治疗性蛋白质的稳定剂。这类赋形剂也用于液体制剂（占30％）。
5、通常会使用氯化钠（NaCl）。我们在大约50％的配方中发现了它。
6、约20％的MAb配方中使用了两种氨基酸（甘氨酸和精氨酸）。
7、所使用的抗氧化剂包括抗坏血酸、蛋氨酸和乙二胺四乙酸（EDTA），这是一种螯合剂，大概是为了防止重金属引起的氧化。但是，它们很少与仅在一种配方中发现的三种抗氧化剂一起使用。
表1 商业化单克隆抗体制剂中使用的赋形剂汇总
二、制剂配方的平台开发方法
单抗药物生产企业开发了一种配方开发平台，用于MAb的快速配方筛选。我们的方法包括对pH和赋形剂进行筛选研究，然后对缓冲液和赋形剂进行深入的评估。
第一阶、段筛选研究筛选最佳pH条件
我们首先在不同pH值的柠檬酸盐，磷酸盐混合物中配制单克隆抗体。在正常pH范围内，柠檬酸盐的酸离解常数（pKa）值为4.8和6.4，磷酸盐的pKa在6.8。两种缓冲盐的混合物使我们能够将pH很好地控制在4–8的范围内。因为所有这些制剂都具有相同的缓冲液组成，所以消除了缓冲液类型对MAb稳定性的影响。我们将制剂在50℃的条件下放置一周，并通过潜在的稳定性指示方法进行分析。我们研究外观，测量不可见颗粒，并应用多种测定方法，例如，差示扫描量热法（DSC）（使用毛细管DSC系统），钠十二烷基硫酸盐-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），结合酶联免疫吸附测定（ELISA）以及分子大小排阻和阳离子交换高效液相色谱（SEC-HPLC，CEX-HPLC）。因此，我们为每个单克隆抗体选择最佳pH条件。我们还评估了每种分析方法检测单抗降解的能力。在以后的研究中将仅使用敏感的稳定性指示方法。
第二阶、段筛选研究以挑选稳定的赋形剂
使用上面选择的pH值，我们最多为此研究选择两种缓冲液。例如，如果目标pH为6，则我们根据组氨酸和柠檬酸的pKa值使用它们。
我们还从上述每个类别中选择一种或两种赋形剂。例如，我们可能添加蔗糖（来自多元醇/二糖家族）、聚山梨酯80（来自表面活性剂家族）、甘氨酸和精氨酸（来自氨基酸家族）、氯化钠（NaCl，一种盐）和蛋氨酸（来自抗氧化剂家族）添加到缓冲液中，以便在此步骤中进行研究。我们通常使用实验筛选设计（DoE）研究。在筛选研究结束时，选择一种或两种稳定的赋形剂和缓冲液用于下一阶段的制剂开发。
第三阶段、最稳定的缓冲液和赋形剂的深度评估
我们使用响应表面方法（Response Surface Methodology，RSM）DoE研究来探索最佳赋形剂浓度和赋形剂之间的相互作用。然后我们在50℃下进行了为期一周的热应力研究。MAb以目标浓度配制，并填充到预期的小瓶/塞子系统中，以模仿最终产品的配置。在研究结束时，我们将选择最终的制剂配方。在大多数配方中，单克隆抗体通常在冻融循环和搅拌过程中都是稳定的。尽管如此，我们还将确认制剂在冻融和搅拌过程中的稳定性。
这种快速而合理且相对全面的方法的筛选周转时间约为12周。我们已经成功地使用了这种平台方法来配制几种单克隆抗体产品的配方。
三、案例研究
我们采用了上述方法，并成功为目标单克隆抗体开发了100mg/mL的液体制剂。通过上述研究，我们确定了其最佳pH为6。我们还缩小了缓冲液和赋形剂的范围。
接下来，我们根据先前的结果进行了DoE研究，并在pH6.0和100mg/mL的条件下配制了单克隆抗体。使用所有筛选条件最佳实验设计，我们研究了包含10–50mM组氨酸、1-2％海藻糖和10–50mM磷酸柠檬酸盐缓冲液的赋形剂。根据在筛选研究中从DSC获得的已知蛋白质展开起始温度（下图1），我们使用45℃作为该产品的热应激温度，将孵育时间延长至14天。
图1 单克隆抗体（MAb）的典型差示扫描量热法（DSC）热分析图，显示了单抗焓变；主峰是由Fab部分和CH2结构域的未折叠引起的，而次峰是CH3结构域的未折叠的。
第二阶段数据的统计分析（下图2–5）表明，柠檬酸、磷酸盐或海藻糖浓度均未显着影响该单克隆抗体的稳定性。组氨酸在抑制聚集体形成方面具有显着的积极作用（p =0.0006），但对蛋白质片段化的影响不明显（p =0.1231）。在测试范围内（10–50mM），较高的组氨酸浓度可提供更好的蛋白质稳定性。
图2 组氨酸和柠檬酸，磷酸盐缓冲液对高分子量（HMW）物种影响的等高线图。
图3 组氨酸和柠檬酸，磷酸盐缓冲液对单体含量影响的等高线图。
图4 组氨酸和柠檬酸盐，磷酸盐缓冲液对低分子量（LMW）物种影响的等高线图。
图5 通过JMP软件分析的分子大小排阻色谱（SEC）数据的预测方差图。
因此，我们选择了一种含有组氨酸的制剂，并进行了24个月的实时稳定性研究。下图6显示了此100mg/mL MAb制剂的结果数据。
图6 100mg/mL MAb制剂的24个月稳定性研究结果
所选测定法的稳定性研究结果表明，该抗体在该制剂中具有长期稳定性。通过这种平台配方开发方法，我们在短短12周内开发了比较良好的单抗制剂配方。
四、方法总结
基于对37种商业化单抗制剂的分析以及制剂配方研究的丰富经验，我们可以建立了针对单抗的快速平台制剂开发策略。此三步过程从pH筛选开始，然后是赋形剂筛选，最后是对最佳稳定缓冲液和赋形剂进行更深入的评估。在短短几周内，研究人员就可以为MAb产品开发开发出稳定的配方。
会议内容
时间：2020年10月24-25日
地点：上海（酒店已定向通知）
规模：500-600人
主办单位：生物制品圈、抗体圈
协办单位：厚泽生物
赞助单位：
会议费用：目前已开启收取会议费，请已登记的老师尽快查看邮件确认！
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参考：
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