文章来源：《介入放射学杂志》，2017,26：588-593
作者：丁 远， 王黎洲， 宋 杰， 蒋天鹏， 周 石
文章来源：《介入放射学杂志》，2017,26：588-593
作者：丁 远， 王黎洲， 宋 杰， 蒋天鹏， 周 石
目的 评估细胞色素P450酶2C19（CYP2C19）基因多态性对经颈静脉肝内门体分流术（TIPS）肝硬化患者术后服用氯吡格雷抗血小板治疗的影响。方法 收集2013年1月至2014年12月接受TIPS术治疗的171例肝硬化患者临床资料。所有患者均于术中采集门静脉及肘静脉血液样本并行CYP2C19基因检测。术后每3个月临床随访，比较分析基因检测结果与临床随访结果。结果 110例TIPS术前无输血且术后规律服用氯吡格雷患者纳入本研究。术后平均服用氯吡格雷时间为192.4 d（31～517 d），门静脉血及肘静脉血基因检测结果一致，CYP2C19基因型为*1/*1有49例（44.5%）、*1/*2有27例（24.6%）、*1/*3有18例（16.4%）、*2/*2有11例（10.0%）、*2/*3有3例（2.7%）、*3/*3有2例（1.8%）；随访显示慢代谢型基因携带患者分流道功能异常发生率为87.5%（14/16），较中等代谢型患者（20.0%，9/45，χ2=22.9，P=0.006）及快代谢型患者（8.2%，4/49，χ2=37.91，P=0.000 1）明显增高；Cox回归模型多变量分析提示CYP2C19慢代谢型基因变异，是分流道功能异常的重要预测因素（95%CI 1.80～9.03，P=0.000 7）。结论 CYP2C19慢代谢基因变异（*2/*2、*2/*3、*3/*3）是影响TIPS术后患者氯吡格雷治疗效果的重要因素之一，术前检测可为术后提供较为有效的抗血小板治疗方案。
肝硬化是慢性肝损伤终末期，门静脉高压作为其主要并发症之一，常影响患者生存期［1- 2］。经颈静脉肝内门体分流术（TIPS）治疗门静脉高压及其并发症效果较为肯定［3- 5］，术后患者需口服氯吡格雷，维持TIPS分流道即植入支架畅通。氯吡格雷是一种前体药物，必须由细胞色素（cytochrome，CY）P450同工酶亚家族2C19（CYP2C19）转化为有活性代谢物［6- 8］，才能被不可逆地结合至P2Y12血小板膜受体［9- 11］，发挥抗血小板聚集功效。CYP2C19基因呈多态性，不同基因型对氯吡格雷代谢速度不一，因此部分健康人或冠心病患者会出现氯吡格雷药效明显减弱［12- 14］。本研究旨在探究门静脉、外周静脉间CYP2C19基因型是否存在差异，评估CYP2C19基因多态性对TIPS术后患者服用氯吡格雷抗血小板治疗的影响。
一、材料与方法
1.1 研究入组标准
本研究遵循赫尔辛基宣言，研究方案获得医院伦理委员会批准。收集2013年1月至2014年12月在贵州医科大学附属医院接受TIPS术治疗的171例肝硬化患者临床资料（年龄、性别等一般信息及术后分流道超声检查结果等）。入组标准：①年龄＞18岁且肝硬化诊断符合科技部“十二五”重大专项联合课题组专家共识标准［15］；②无全身感染状态；③有TIPS术适应证，如再次消化道出血和/或难治性腹水；④排除TIPS术禁忌证，如肝性脑病＞1级、有急性出血、胆红素＞85.5 μmol/L或伴发肺动脉高压；⑤手术前未接受输血治疗；⑥无门静脉血栓形成；⑦TIPS术中将采集门静脉及肘静脉血液样本。
1.2 TIPS手术及围术期处理
穿刺右侧颈内静脉，引入RUPS- 100穿刺系统（美国Cook公司），经肝静脉穿刺门静脉左支进入门静脉；经导丝引入猪尾导管于脾静脉远端减影了解胃冠状静脉引流情况，将猪尾导管头端置于门静脉主干测量门静脉压（cmH2O）；更换硬导丝，逆时针扭转导向器，将12 F外鞘引入门静脉主干，保留硬导丝，退出导向器；经导管用弹簧钢圈（美国Cook公司）、明胶海绵颗粒（杭州艾力康公司）、组织胶（北京福爱乐公司）等栓塞材料栓塞扩张的胃冠状静脉，栓塞结束后经硬导丝引入球囊（直径6、8、10 mm，美国Cordis公司）扩张分流道，参照球囊扩张切迹植入Fluency全覆膜支架（直径6～10 mm，长4～10 cm，美国Bard公司），再次引入猪尾导管至脾静脉远端，行脾静脉及门静脉主干造影确认支架无近心端及门静脉端“盖帽”情况；术毕将猪尾导管退至门静脉主干再次测量门静脉压，测压后拔出导管鞘，压迫穿刺点15 min后加压包扎。术中分别用乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝管采集患者肘静脉血液及门静脉血液各5 ml（2～8℃保存），并于48 h内检测。
TIPS术后低蛋白饮食1个月，后经3～6个月逐步恢复正常饮食。手术当日起皮下注射低分子肝素（昆明积大制药公司）4 250 U/12 h，连用7 d；口服氯吡格雷（德国Bayer公司）75 mg/d 6个月以上。
1.3 基因检测及分型
采用TaqMan荧光探针标记的实时定量聚合酶链反应（RT- qPCR）进行基因检测。提取基因组DNA的仪器试剂有血液基因组提取试剂盒（中国天根生化科技公司）、1.5 ml离心管、漩涡混合器、55℃水浴箱、台式离心机（14 000 rpm）、96%～100%乙醇。采用离心法纯化基因组DNA。按照DNA检测试剂盒（人CYP2C19基因分型检测试剂盒，中国苏州旷远生物技术公司）说明书进行荧光PCR扩增（LightCycler?誖480实时荧光定量PCR系统，瑞士Roche公司），扩增体系为TaKaRa Ex Taq Hs（5 U/μl）0.2 μl、10×Ex Taq Buffer（Mg2+ plus，2.5 mmol/L）2 μl、dNTP mixture（2.5 mmol/L）1/μl、正向引物（10 μmol/L） 0.5 μl、反向引物（10 μmol/L）0.5 μl、DNA 1 μl、dH2O加至20 μl。扩增反应循环参数：95℃预变性5 min，94℃变性30 s，56℃退火20 s，72℃延伸2 min，共重复40 次，最后再延伸5 min，4℃保存。采用ABI 3730XL型全自动DNA测序仪（美国Applied Biosystems公司）对扩增产物进行双向测序，４管独立PCR反应体系分别检测每份血液样本CYP2C19等位基因681G、681A、636G、636A。
CYP2C19基因型分为3种表型：①快代谢型：携带正常功能等位基因（*1/*1）；②中等代谢型：携带1个失活等位基因（*1/*2、*1/*3）；③慢代谢型：携带2个失活等位基因（*2/*2、*2/*3、*3/*3）［16］。
1.4 排除标准及研究数据收集
排除标准：①术后未按要求服用氯吡格雷（75 mg/d）；②术后失访；③术后接受过输血治疗；④术后再发消化道出血。
分别在TIPS术前、术后14 d和术后1、3、6、12个月对患者进行随访，复查TIPS分流道超声、是否再发出血、腹水情况、血常规、肝肾功能、凝血功能、血脂等指标。随访终点事件为：①超声发现TIPS分流道功能异常；②患者死亡；③再次接受分流道球囊扩张和/或支架植入，或平行TIPS治疗。分流道功能异常定为：超声提示支架内有血栓形成或支架内可探及充盈缺损、支架内血流充盈不良、支架内血流流速明显减低及支架内未探及血流信号等表现［17］。
1.5 统计学分析
采用 SPSS 18.0软件和GraphPad Prism 5.00软件对所有数据进行比较分析，数据表示为均数±标准误（SEM）或中位数和范围，用卡方检验比较各基因型分组间术后血栓形成率，用Spearman相关系数作相关性分析，Cox回归模型多变量分析、对数秩检验分析术后分流道血栓形成的影响因素，P＜0.05为差异有统计学意义。
二、结果
2.1 患者临床资料
纳入本研究肝硬化患者共110例，其中男67例（60.9%），女43例，平均年龄58.7岁；Child- Pugh肝功能评分为7.9分，主要为B级；TIPS术适应证为再出血二级预防41例，顽固性腹水52例，两者均有17例；术前仅7例出现肝性脑病。术后平均随访时间为289.7 d，平均服用氯吡格雷时间为192.4 d。（表1）。
2.2 TIPS前后血生化参数变化
TIPS术后随访14 d，所有患者肝脏合成能力，如胆碱酯酶和国际标准化比值（INR）水平保持不变；TIPS术后γ- 谷氨酰转肽酶（γ- GT）、谷氨酸转氨酶（ALT）、天冬氨酸转氨酶（AST）及胆红素等肝损伤指标略有升高，但肾功能改善；术前有明显门静脉高压患者术后14 d门肝静脉压力梯度明显降低，血流速度明显改善（表2）。
2.3 CYP2C19基因型检测
110例患者门静脉及肘静脉血液样本经基因检测结果一致，快代谢基因型49例（44.5%），中等代谢型45例（40.9%），慢代谢型16例（14.6%）；CYP2C19基因型为*1/*1有 49例（44.5%）、*1/*2为27例（24.6%）、*1/*3为18例（16.4%）、*2/*2为11例（10.0%）、*2/*3为3例（2.7%）、*3/*3为2例（1.8%）（图1）。
2.4 TIPS分流道功能异常与CYP2C19基因型
术后随访3个月时，凝血功能及血脂等相关指标在慢代谢型和中等代谢型基因携带患者间差异，均无统计学意义——纤维蛋白原血浆浓度（3.4 g/L对3.3 g/L，P＝0.59）、纤溶酶原激活物抑制因子- 1 （43.5 ng/ml对38.9 ng/L，P＝0.38）、D-二聚体（307 ng/ml对303 ng/ml，P＝0.82）、总胆固醇（1.88 g/L对1.74 g/L，P＝0.29）、低密度脂蛋白胆固醇（1.20 g/L对1.02 g/L，P＝0.67）；在慢代谢型和快代谢型基因携带患者间差异，也均无统计学意义——纤维蛋白原血浆浓度（3.4 g/L对3.2 g/L，P＝0.72）、纤溶酶原激活物抑制因子-1（43.5 ng/ml对37.9 ng/L，P＝0.38）、D-二聚体（307 ng/ml对301 ng/ml，P＝0.47）、总胆固醇（1.88 g/L对1.75 g/L，P＝0.22）、低密度脂蛋白胆固醇（1.20 g/L对0.97 g/L，P＝0.10）。
术后随访显示，慢代谢型基因携带患者分流道功能异常发生率为87.5%（14/16），较中等代谢型患者（20%，9/45，χ2＝22.9，P＝0.006）及快代谢型患者（8.2%，4/49，χ2＝37.91，P＝0.000 1）明显增高；且较非慢代谢型患者（9.6%，9/94）明显增高（表3）。Cox回归模型多变量分析提示，CYP2C19慢代谢型基因变异是分流道功能异常的重要预测因素（95%CI 4.01，1.80～9.03，P＝0.000 7）。
三、讨论
TIPS手术是目前肝硬化所致门静脉高压及其并发症的微创治疗方法，用于治疗食管胃底静脉曲张破裂大出血优于内镜和传统药物治疗［18］，且可避免外科开腹手术创伤大、并发症多及术后恢复慢等弊端。然而术中尤其是穿刺过程中可能会损伤血管，从而启动凝血机制，同时植入支架为异物等原因可增加TIPS分流道血栓形成风险。覆膜支架虽可降低TIPS通道功能障碍（血栓形成、狭窄/闭塞）发生，但支架植入并给予抗凝治疗后仍会发生［19］。因此，TIPS术后分流道功能异常已成为肝硬化介入治疗亟待解决的难题之一。
美国肝病研究学会（AASLD）实践指南指出，TIPS术后血栓所致TIPS通道功能障碍发生率为10%～15%，不推荐在缺乏更多研究情况下常规应用抗凝药物［20］。中华医学会消化病学分会消化介入学组2013年《TIPS术治疗肝硬化门静脉高压共识》指出，急性血栓多于术后24 h形成，可能与胆汁漏、高凝状态和支架选择不当有关；术后抗凝治疗方案虽缺少临床研究证据，但多数学者建议术后短期抗凝，如低分子肝素可减少急性血栓发生，是否应用抗血小板等药物有待进一步临床研究。超声检查是TIPS术后随访分流道的首选方法，门静脉造影可确诊有无分流道失效，处理措施主要有球囊扩张、支架植人或平行TIPS［20］。氯吡格雷是TIPS术后常用的保持分流道畅通的抗血小板药物，其本质是一种前体药物，需通过大量CYP2C19转化为活性代谢物，才具有抗血小板聚集活性，但既往研究表明部分患者存在氯吡格雷抵抗［21］。大量研究表明，临床应用氯吡格雷疗效应考虑不同个体差异，部分患者反应较差；许多因素会影响氯吡格雷疗效，如同时应用其它细胞色素P450抑制药物、患者年龄、一些并发症（肾衰竭、2型糖尿病）以及患者治疗依从性较差。然而，不同个体患者基因所构成药物代谢酶差异也是影响疗效的重要原因之一［22］。影响氯吡格雷疗效的药物基因组学变量研究已确定许多可能因素，如基因产物ATP结合盒B亚家族成员1转运蛋白（ABCB）参与肠道吸收，酶转化/激活（CYP2C9、2C19、2B6、3A4、3A5）及血小板二磷酸腺苷P2Y12受体对氯吡格雷活性代谢物的反应。除了上述潜在变量，体外抑制血小板黏附与临床结果一致的患者基因产物为CYP2C19基因型［23- 24］。
高等级多形态CYP2C19基因具有至少22对确定等位基因变体［25］，其中仅4种（CYP2C19*1、*2、*3、*17）证实为大多数人类最常见等位基因［26］。CYP2C19* 1或野生型等位基因编码是正常活性酶，且为最常见鉴定等位基因，约70%白人均有［27］。CYP2C19*2等位基因（RS- 4244285）中包含剪接位点缺陷，CYP2C19*3等位基因（RS- 4986893）中包含一提前终止密码子，均不能转化为功能酶。这两种不能作为功能酶的等位基因编码被视为功能缺陷性等位基因，有任何这两种等位基因之一和1号等位基因组合患者被认为是一种中间代谢表型；有2个功能缺陷性等位基因时CYP2C19不能表达任何功能，被认为是CYP2C19底物弱代谢表型［28］。本研究检测到入组患者快代谢基因型占44.5%，中等代谢型为40.9%，慢代谢型为14.6%，与国内报道的比率相似［29］。
近期有研究认为，携带至少1个CYP2C19 弱代谢型等位基因（CYP2C19*2或CYP2C19*3）患者体内转化氯吡格雷成活性能力降低，抑制血小板聚集能力下降［30］。本研究同样发现慢代谢型基因型患者TIPS术后虽规律服用氯吡格雷，但分流道功能异常发生率仍远高于中等代谢型及快代谢型患者。美国食品药品监督管理局（FDA）建议临床上给予患者口服氯吡格雷前检测CYP2C19基因型，以确定患者是否为慢代谢型。对氯吡格雷慢代谢型患者，可采用其它抗血小板药物或增加用药剂量。增加用药剂量虽确能改善慢代谢型患者抗血小板效果，但合适剂量范围尚在临床试验阶段［31］。动物实验研究表明，西洛他唑可维持TIPS分流道通畅，不失为TIPS术后慢代谢型患者另一抗血小板治疗方案［32］。
总之，CYP2C19慢代谢基因变异（*2/*2、*2/*3、*3/*3）是影响TIPS术后患者氯吡格雷治疗效果的重要因素之一，术前检测可为术后提供较为有效的抗血小板治疗方案，从而延长TIPS分流道使用时间，提高TIPS术远期疗效。
参考文献（略）
（收稿日期：２０１6-11-12）
（本文编辑：边 佶）
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