射频消融亚致死性温度对肝癌干细胞的影响

文章来源：《介入放射学杂志》，2017,26：636-640

作者：郝美君，刘   凯，郭向华， 欧阳雅博，乔录新，石   英，陈德喜，郑加生

摘要

目的   研究亚致死温度射频消融（RFA）对肝癌干细胞（LCSC）产生及其相关转录因子表达的影响。方法   利用小鼠Hep1-6肝癌细胞株和肝细胞癌（HCC）患者临床样品，检测LCSC相关标志物和转录因子的表达。结果   不同温度分别刺激Hep1- 6细胞后发现，45℃是不能诱导细胞死亡的亚致死性温度。流式细胞仪（FCM）检测显示45℃处理可引起CD13+、CD44+、CD90+、CD133+ Hep1- 6细胞水平明显上调，提示45℃温度导致Hep1- 6细胞中以上各型LCSC产生增加；实时定量聚合酶链反应（RT- qPCR）检测显示45℃温度导致CD13、CD90、CD133 mRNA水平明显上调。CD13 mRNA水平在5例HCC患者复发肝癌组织中均明显上调，CD133 mRNA在4例复发肝癌中上调，CD90 mRNA仅在1例复发肝癌中上调；FCM检测显示CD13+ LCSC水平在4例复发肝癌中明显上调，CD133+ LCSC水平仅在1例复发肝癌中上调，提示CD13+ LCSC水平上调与45℃温度关系更密切。RT- qPCR检测显示4例CD13+ LCSC上调的复发肝癌患者13个LCSC相关转录因子中Sox2、Stat1明显上调，FCM检测显示45℃处理Hep1- 6细胞后Sox2、Stat1 mRNA明显上调。用Sox2、Stat1 siRNA分别沉默了Sox2、Stat1基因，表明Sox2、Stat1均参与了45℃温度诱导的CD13+ LCSC产生。结论   RFA治疗中45℃亚致死性温度所致CD13+ LCSC水平增高与Sox2、Stat1表达有关。该结果对肝癌复发研究有一定借鉴意义。

肝细胞癌（HCC）致死率在我国排名第2［1- 2］，目前主要治疗手段除了手术切除和肝移植外，以射频消融（RFA）为代表的微创治疗也得到广泛应用［3- 4］。RFA以灼损方式杀死局部肿瘤，但其热量辐射也会使局部区域亚致死性温度不能杀伤肿瘤细胞而导致残癌发生。长期随访资料表明一次RFA治疗的残癌发生率为3%～52%，且复发率较高（50%～65%）［5- 7］，甚至5年后复发率高达91％［7- 8］。肿瘤干细胞（CSC）在肿瘤细胞中所占比颇小，具有自我更新、无限分裂和多能性等特点，对放疗和化疗有很强的抵抗能力［9］。在大部分肿瘤细胞被杀死情况下，存活CSC可作为“种子”导致肿瘤复发［7- 8］。研究表明CSC与机体正常干细胞共享一套转录因子（Oct4、Sox、Nanog等），对维持CSC和正常干细胞的干性发挥关键作用［9- 10］。肝癌干细胞（LCSC）在肝癌复发中作用主要涉及手术切除后肝癌复发研究，LCSC与RFA治疗后肝癌复发研究相对较少。本研究主要探讨RFA治疗与LCSC产生的关系。

一、材料与方法

1.1  临床样品采集

5例初发HCC患者RFA治疗前和肝癌复发后接受穿刺，收集肝癌组织，并保存于液氮中。患者临床资料见表1、图1。

1.2  细胞培养和不同温度处理

高糖DMEM培养基购自美国HyClone公司，胎牛血清、胰酶、青链霉素购自美国Gibco公司。将小鼠Hep1- 6肝癌细胞株接种于每孔含200 μl DMEM完全培养基（含10%胎牛血清和1%青链霉素）的24孔细胞培养板中，置于37℃、5% CO2孵箱培养。将细胞消化并收集在1.5 ml离心管中，分别置于37、40、45、50、55℃金属浴仪上10 min，然后将细胞重新铺板，正常培养24 h。

1.3  RNA提取和实时定量聚合酶链反应检测

将Hep1- 6细胞和肝癌组织制成匀浆，用TRIzol试剂提取总RNA。按TaKaRa逆转录试剂盒说明书（大连宝生物工程公司）操作生成cDNA。每个cDNA样品10倍稀释，按SYBR Green试剂盒（美国ABI公司）说明书进行实时定量聚合酶链反应（RT- qPCR）检测。每孔8 μl，条件为4 μl SYBR Green Mix，1 μl 10倍稀释模板，上下游引物各0.5 μl，最后用去离子水补至8 μl；95℃ 15 s，60℃ 40个循环。各基因引物购自美国Bio- Rad Laboratories公司。

1.4  RNA干扰试验

按Kim等［7］报道方法进行RNA干扰实验。Sox2、Stat1 siRNA和对照siRNA购自美国Santa Cruz 生物技术公司。Lipo2000转染siRNA 24  h后继续以下检测。

1.5  细胞活性、流式细胞仪检测和免疫印迹检测

按MTT法细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒说明书所示完成细胞活性检测，具体方法参照Nguyen等［9］文献报道。流式细胞仪（FCM）检测（抗体均购自美国BD医疗公司）和免疫印迹检测（抗体购自英国Abcam公司）过程参照Yamashita等［10］文献报道。

1.6  统计分析

计量资料用均数±标准差（ｘ±ｓ）表示，组间比较用单因素方差分析，95%作为显著性差异。

二、结果

2.1  亚致死性温度导致LCSC水平增加

MTT法检测显示，Hep1- 6细胞分别经37、40、45℃处理未出现死亡，50℃时40％细胞死亡，55℃导致90％细胞死亡（图2①）。后续实验中将45℃用作亚致死性温度。FCM检测结果显示，45℃处理导致CD13+、CD44+、CD90+、CD133+ Hep1-6细胞水平明显上调，提示亚致死性温度处理Hep1- 6细胞导致各型LCSC水平增加（图2②）。RT- qPCR检测进一步发现，45℃处理导致CD13、CD90、CD133 mRNA水平明显上调（图2③），说明CD13+、CD90+、CD133+ LCSC产生与CD13、 CD90、CD133转录增加有关。

2.2  CD13+ LCSC上调与RFA亚致死性温度有关

RFA术前后肝癌组织匀浆中CD13 mRNA水平在5例患者复发肝癌组织中均显著上调，CD133 mRNA在4例复发肝癌中上调，CD90 mRNA仅在1例复发肝癌中上调（图3①②③）。CD13、CD133表达上调与亚致死性温度处理的Hep1- 6细胞结果一致。FCM检测显示，4例患者复发肝癌中CD13+ LCSC水平较初发肝癌明显上调，CD133+ LCSC水平仅在1例患者中上调（图3④⑤），提示CD13+LCSC水平上调与RFA产生的亚致死温度有关。

2.3  亚致死性温度使Sox2、Stat1上调

RT- qPCR检测显示，4例复发肝癌患者13个LCSC相关转录因子中仅有Sox2、Stat1明显上调，CDX2、JUN、Nnaog、TBX2、c- Myc、KLF4、TBX5、TBX3、LIN28、Oct4、KLF2表达下调（图4①）。FCM检测显示，45℃亚致死温度处理Hep1-6细胞后，Sox2、Stat1表达也明显上调（图4②）。

2.4  Sox2、Stat1参与CD13+LCSC产生

免疫印迹检测显示，Sox2、Stat1 siRNA经Hep1- 6细胞转染，可有效地沉默Sox2、Stat1基因表达（图5）；FCM检测显示，Hep1- 6细胞中用Sox2和Stat1 siRNA分别沉默Sox2、Stat1基因后，45℃亚致死性温度处理诱导的CD13+LCSC水平明显降低，表明Sox2、Stat1参与了亚致死性温度诱导的CD13+LCSC产生，即亚致死性温度可能通过上调Sox2、Stat1表达促进CD13+ LCSC产生。

三、讨论三、讨论三、讨

三、讨论

目前关于LCSC对RFA治疗后肝癌复发影响的研究报道仍然少见。本实验结果显示，RFA治疗可促进CD13+ LCSC生成。诸多文献报道CSC是肿瘤复发的关键因素［10- 11］，因此CD13+ LCSC很有可能是促进RFA治疗后肝癌复发的关键原因。本实验进一步表明，RFA治疗中产生的亚致死性温度是促进CD13+ LCSC产生的关键因素，这与许多RFA研究报道一致——RFA对肿瘤不完全灼损导致残瘤［12］，残瘤中CSC致使肝癌再次复发［13］；即使RFA使肿瘤组织完全坏死，但CSC仍存在于癌旁组织［14］。因此，抑制LCSC产生，应是降低或减缓RFA治疗后肝癌发生的有效方法。

本实验也显示Sox2、Stat1是CD13+ LCSC产生的关键转录因子。有研究认为，手术后Sox2、Oct4、Nanog表达上调，预示肝癌复发可能性较大［15- 16］。RFA治疗后Sox2表达上调，但Sox2表达水平是否可预测RFA后肝癌复发情况，仍需后续实验验证大量临床样本后才能确定。正常干细胞和CSC中，Sox2结合Oct4形成的异源二聚体，可结合至Nanog启动子上直接诱导Nanog表达［17］，而Nanog水平对于维持正常干细胞和CSC干性至关重要［18］。但Sox2表达上调介导的CD13+ LCSC产生是否也与Nanog、Oct4有关，有待进一步验证。Stat1是Stat家族中首个成员，对Ⅰ、Ⅱ型干扰素激活起关键作用。有研究报道，包括肝癌在内的许多癌症组织中发现Stat1表达上调［19］。少有研究报道Stat1在CSC中的作用，更多文献报道Stat1在正常干细胞发生中的作用［20］。

总之，本实验结果提示Stat1参与了RFA治疗引起的LCSC发生，为进一步研究RFA治疗后肝癌复发提供了研究新靶点。

参考文献（略）

（收稿日期：２０１7-01-16）

（本文编辑：边   佶）