临床杀菌药物快速筛选实验

      毕淑珍1，吕小钧2，吴学宝3
      （1.浙江省遂昌县动物疫病预防控制中心，浙江遂昌323300；2.浙江省庆元县动物疫病预防控制中心，浙江庆元323800；3.庆元县农业局，浙江庆元323800）
      2016 年11月初，某大鲵养殖场发生病害，到中旬仍不能有效控制病害。为此我们用药敏实验进行药物敏感度的测定，以便准确有效的利用药物进行治疗。现介绍如下：
      1 准备工作
      1.1 器械材料准备
      接种环灭菌器、酒精棉球、移液器、有盖
      小试管、接种环、培养基、纯水、菌株等置入生物安全柜。有盖小试管置微波炉灭菌1~2min，高纯水先置微波炉至沸并自然冷却。
      1.2 接种室消毒
      药物筛选前接种室和生物安全柜开启紫外线灯30min。
      1.3 人员准备
      接种人员在缓冲间穿防护服，戴手套、口罩、工作帽进入接种室。
      1.4 细菌混悬液制备
      挑取无菌采集病料培养20h 后的菌落1 个，高纯水40μL，制成细菌混悬液。
      1.5 各种待试药剂制备
      盐酸恩诺沙星5mg/mL；强力霉素5mg/mL；阿莫西林5mg/mL；痢菌净10mg/mL；庆大霉素120IU/mL；食盐水30mg/mL。
      2 混合杀菌
      取各待试药液20μL+ 细菌混悬液2μL，室温下摇床低速震荡作用100min。
      3 接种培养观察
      培养基划分成7 份并编号，空白为细菌混悬液对照。将作用后的抗菌素细菌混合液按序号分别接种于培养基各分区，25℃培养。培养20h 后观察，对照区菌落密集，强力霉素和阿莫西林区域菌落较对照区少，判为低敏；食盐水和痢菌净区菌落数较少，判为中度敏感；盐酸恩诺沙星和庆大霉素区无菌落生长，判为高度敏感（见图1）。
      4 实验后处理
      实验结束后开启紫外线灯60 min。金属接种环在灭菌器中灭菌，移液器用75%酒精或1:100 的10%百毒杀等消毒药擦拭，其他废弃物用15 磅121℃ 20min 湿热高压灭菌。数量不多的培养皿也可置微波炉中灭菌，2min 即可杀灭细菌。
      5 小结与讨论
      5.1 抗菌药对细菌性传染病的控制起到非常重要的作用，按部就班的药敏试验操作繁琐、时间长、费用大，养殖户在时间上也等不起，本方法可以在较短的时间内筛选出有效抗菌药物。本方法不需要昂贵的仪器设备，仅需肉眼判读，即可以提供简单明了的药敏判断结果。本方法也可以消除商品药敏片与实际使用药物来源不同厂家、批次而造成的差异。
      5.2 本次实验待试药物浓度的确是高了，但并不是养殖池实际用药浓度。主要考虑细菌混悬液中细菌含量极高，我们的目的是选出敏感药物，若按商品药敏片的比例配制药液可能无法筛选出有效的药物。作为一种直观准确、快速、低成本、易于操作的药敏检测方法，不应有过多的苛求。大鲵对水质变化十分敏感，养殖池中水质稍有变化，即有应激反应，药量过高对肝肾功能肯定有损害，实际施药浓度仍要视大鲵耐受情况而定。若需要测定体外最低抑菌浓度（MIC)，细菌混悬液经倍比稀释后用本法同样可以测定出。
      5.3 本方法设备要求不高，适合具条件的养殖场或动物诊所进行药敏试验的操作。目前县级动物疫病预防控制中心超净工作台是最低配置，已具备本实验方法的基本条件。
      5.4 超净工作台和生物安全柜空间小，基层动物疫控中心的工作人员多数不是专职从事细菌学工作，在超净工作台和生物安全柜内接种时易划破培养皿内琼脂，在确保细菌不散逸和自身防护安全的情况下可考虑在超净工作台和生物安全柜外操作，但接种前接种室紫外线灯开启时间为60min。