我们常说,科学家也是艺术家,在明确真理探索科学的道路上,往往会创造出很多极具美感的艺术作品,比如下面的这些实验结果图,美吧~
---Olson, B. D. and Downes, G. B.
---in situ Hybridization of wild type Drosophila embryos
所以今天小笔为大家介绍的就是能做出这种美美图的新技能,原位杂交实验~
基本原理
简单点说就是碱基互补配对原则。官方来讲的话,就是我们将外源核酸(也就是常说的分子探针)与组织、细胞上待检测的DNA或RNA进行配对,形成核酸杂交分子,再经过一定手段将这个杂交分子的位置显示出来。
实验技术的更新是很快的,在明确了该技术的可行性后,科学家进一步改进并进行分类,主要有以下几类:
荧光原位杂交技术:DNA分子原位杂交技术;在原技术手段上增加了荧光元素,技术手段较为先进,易掌握,运用广泛,一会儿小编会着重介绍哦~毕竟,能够在我们自己的实验中运用上,才是我们的最终目标嘛。
多彩色荧光原位杂交技术:显而易见,是荧光原位杂交的升级版,采用多个荧光来检测,目前的发展及运用也是较多的。
原位PCR:将原位杂交结合PCR技术发展起来的实验方法。说实话,了解的比较少,我就不班门弄斧了,呵呵。
基因组原位杂交技术:该技术在我们的领域可能运用的毕竟少,主要是根据物种DNA同源性差异实现,在农作物等的杂交育种上运用较广,我就不详细介绍啦~
结合示意图可以更好的理解哦~
实验材料(重要的,基础材料不赘述)
1. 4%多聚甲醛(1x PBS配置):固定剂
2. 蛋白激酶K:使得靶核酸暴露,增加探针和靶核酸结合。
3. 杂交缓冲溶液
实验步骤
取材:动物组织取材(小鼠采用心脏灌流法)后在4%的多聚甲醛中固定4小时左右, 1x PBS洗5次,每次30分钟,用25%蔗糖脱水过夜(均在4°进行)。样品做OTC冰冻切片,厚度16 mM,收集在载玻片上,冷冻于-20℃。
1. 原位杂交:
(1)取出玻片,在50℃预热15 min,放入原位杂交盒中,加入新鲜配制的4%多聚甲醛,室温固定30分钟,DEPC-PBS洗三次。用10 µg/ml的蛋白激酶K处理组织10~15 min,DEPC-PBS洗三次。
(2)4%多聚甲醛,室温固定15 min,用水洗一遍后,加入预杂交液置于65℃烘箱内。 4h后,回收预杂交液,加入含1-2 µg/ml探针的杂交液, 65℃过夜。
(3)次日,用65℃的2× SSC洗涤5 min, 2-3次。将载片转移至玻璃固定盒中65℃加入搅拌子搅拌15 min,加入RNaseA 0.2µg/ml, 37℃ 30 min。 65℃的1× SSC冲洗一次,再用0.2× SSC洗涤3次, 每次30 min。
(4)室温下,用含15%的羊血清封闭载片1h。滴加生物素化鼠抗地高辛,室温2h。 PBT洗涤3次,每次30 min。 用新鲜配制的碱性磷酸酶液洗涤3次,每次5 min。加入含有50 µg/ml的NBT和BCIP的碱性磷酸酶液孵育过夜。
(5)观察信号,如果信号足够强,用多聚甲醛停止试验,用甘油封片,采集图片。
小笔,浙江大学药学院一名普通老博,“长期奋斗”在肿瘤药理及神经药理学领域,经常跟老鼠细胞啥么的打交道,虽然毕业滚蛋了,但仍然会活跃在这几个领域继续做实验,聊八卦。其实小笔最初的自我定位是成为一枚文艺女青年,不过每天在实验室泡着久而久之也就只是枚伪文青了。小笔想用一颗文艺加逗比的心,把枯燥的实验操作转化为轻松清新的语言传递给大家,生活还是可以很美好,课题实验也还是可以继续哒!
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