原位杂交技术（in situ hybridization, ISH）

我们常说，科学家也是艺术家，在明确真理探索科学的道路上，往往会创造出很多极具美感的艺术作品，比如下面的这些实验结果图，美吧~

---Olson, B. D. and Downes, G. B.

---in situ Hybridization of wild type Drosophila embryos

所以今天小笔为大家介绍的就是能做出这种美美图的新技能，原位杂交实验~

基本原理

简单点说就是碱基互补配对原则。官方来讲的话，就是我们将外源核酸（也就是常说的分子探针）与组织、细胞上待检测的DNA或RNA进行配对，形成核酸杂交分子，再经过一定手段将这个杂交分子的位置显示出来。

实验技术的更新是很快的，在明确了该技术的可行性后，科学家进一步改进并进行分类，主要有以下几类：

荧光原位杂交技术：DNA分子原位杂交技术；在原技术手段上增加了荧光元素，技术手段较为先进，易掌握，运用广泛，一会儿小编会着重介绍哦~毕竟，能够在我们自己的实验中运用上，才是我们的最终目标嘛。

多彩色荧光原位杂交技术：显而易见，是荧光原位杂交的升级版，采用多个荧光来检测，目前的发展及运用也是较多的。

原位PCR：将原位杂交结合PCR技术发展起来的实验方法。说实话，了解的比较少，我就不班门弄斧了，呵呵。

基因组原位杂交技术：该技术在我们的领域可能运用的毕竟少，主要是根据物种DNA同源性差异实现，在农作物等的杂交育种上运用较广，我就不详细介绍啦~

明确了以上的分类及原理后，接下来小编主要讲讲在我们的领域中运用较广的荧光原位杂交方法。

结合示意图可以更好的理解哦~

实验材料（重要的，基础材料不赘述）

1.  4%多聚甲醛（1x PBS配置）：固定剂

2.  蛋白激酶K：使得靶核酸暴露，增加探针和靶核酸结合。

3. 杂交缓冲溶液

实验步骤

取材：动物组织取材（小鼠采用心脏灌流法）后在4%的多聚甲醛中固定4小时左右， 1x PBS洗5次，每次30分钟，用25%蔗糖脱水过夜（均在4°进行）。样品做OTC冰冻切片，厚度16 mM，收集在载玻片上，冷冻于-20℃。

1. 原位杂交：

（1）取出玻片，在50℃预热15 min，放入原位杂交盒中，加入新鲜配制的4%多聚甲醛，室温固定30分钟，DEPC-PBS洗三次。用10 µg/ml的蛋白激酶K处理组织10~15 min，DEPC-PBS洗三次。

（2）4%多聚甲醛，室温固定15 min，用水洗一遍后，加入预杂交液置于65℃烘箱内。 4h后，回收预杂交液，加入含1-2 µg/ml探针的杂交液， 65℃过夜。

（3）次日，用65℃的2× SSC洗涤5 min， 2-3次。将载片转移至玻璃固定盒中65℃加入搅拌子搅拌15 min，加入RNaseA 0.2µg/ml, 37℃ 30 min。 65℃的1× SSC冲洗一次，再用0.2× SSC洗涤3次， 每次30 min。

（4）室温下，用含15%的羊血清封闭载片1h。滴加生物素化鼠抗地高辛，室温2h。 PBT洗涤3次，每次30 min。 用新鲜配制的碱性磷酸酶液洗涤3次，每次5 min。加入含有50 µg/ml的NBT和BCIP的碱性磷酸酶液孵育过夜。

（5）观察信号，如果信号足够强，用多聚甲醛停止试验，用甘油封片，采集图片。

实验专栏主编

小笔，浙江大学药学院一名普通老博，“长期奋斗”在肿瘤药理及神经药理学领域，经常跟老鼠细胞啥么的打交道，虽然毕业滚蛋了，但仍然会活跃在这几个领域继续做实验，聊八卦。其实小笔最初的自我定位是成为一枚文艺女青年，不过每天在实验室泡着久而久之也就只是枚伪文青了。小笔想用一颗文艺加逗比的心，把枯燥的实验操作转化为轻松清新的语言传递给大家，生活还是可以很美好，课题实验也还是可以继续哒!