补阳还五汤对PAF诱导的PC12细胞损伤的神经保护作用

脑血管疾病是危害人类生命与健康的常见病和多发病,是目前人类疾病的三大死亡因为之一,存活者中50％～70％病人遗留瘫痪、失语等严重残疾,给社会和家庭带来沉重的负担。寻找新的治疗方法已经成为当今神经科学领域的热点。神经细胞是组成神经系统的基本功能单位,其正常的代谢活动的维持高度依赖于持续稳定的血液供应。任何全身或局部因素使脑组织血流量降低至一定阈值时均可导致神经细胞损害。神经细胞的保护治疗旨在提高神经细胞对任何因为引起的内环境紊乱的耐受力与抵抗力,阻断神经细胞坏死的不同环节,使细胞在病理环境中的生存能力增强,促进神经细胞功能的恢复。随着溶栓、抗凝等对急性缺血性脑卒中治疗方法的确认,神经细胞保护越来越具有重要的临床意义。
　　 血小板活化因子(platelet-activating factor,PAF),是一种具有生物活性的脂质递质,其诱导的血小板聚集过程不依赖于腺苷二磷酸(ADP)或花生四烯酸(AA)的代谢产物TXA2,被认为是诱导血小板聚集的第三条途径。PAF参与多种病理、生理过程,与血管内皮细胞、血小板等相互作用,在血栓形成过程中起着重要作用。它与缺血性脑血管病的关系越来越受到重视,从动脉硬化到中风恢复的各个环节上PAF都可能起重要作用。为了防治缺血性脑血管病,抑制PAF诱导的病理过程是必要的,其中一个重要的方法可能是PAF抑制剂的应用。
　　 现代医学中的脑血管疾病,在祖国医学中属中风范畴。中医药治疗中风历史悠久,以整体观念、辨证论治为基础,对中风病的预防、治疗、康复具有独特理念,积累了大量、丰富的理论知识和治疗经验。
　　 补阳还五汤出自清代名医王清任的《医林改错》,由生黄芪、当归尾、赤芍、地龙、川芎、桃仁、红花组成,是根据元气亏虚、气不能帅血行,发生血瘀而创制的补气活血通络方,具有补气、活血、通络之功,临床广泛用于治疗或预防缺血性脑血管病、冠心病、心肌梗塞及其它血栓栓塞性疾病,是目前治疗中风等血栓性疾病应用频率最高的方剂。1999年开始实验研究发现补阳还五汤具有神经保护作用,主要为对神经元缺氧凋亡的保护作用,其药物血清能够促进周围神经再生,可促进神经干细胞的生长、存活和向神经元及神经胶质细胞的分化,对常规和缺氧条件下神经元均有显著的促细胞生长作用,促进胚胎神经上皮细胞的生长外,还可促其分化成神经元和神经胶质细胞的作用。目前中药防治神经细胞损伤的研究已取得了一定的成绩,为临床防治神经细胞损伤积累了一定的理论基础。我们课题前期也研究发现补阳还五汤可明显改善脊髓损伤(SCI)大鼠后肢运动功能,减少SCI大鼠内源性PAF含量,发挥对损伤脊髓的保护作用,其降低SCI大鼠血浆中PAF含量与改善其后肢运动功能相关。对损伤脊髓的保护作用可能与其能减少PAF-R数目,抑制PAF-R活性,从而阻断PAF发挥损伤效应有关。
　　 由于神经细胞培养在缺血性脑损伤研究中的优势,如研究对象是活的神经细胞、研究的条件可以人为地控制、研究的神经细胞样本可以达到比较均一性、研究的内容便于观察、检测和记录,以及充分地满足实验的要求及研究费用较经济等,因此利用神经细胞损伤的细胞模型在神经细胞保护作用研究中显得尤为重要。本研究结合缺血性神经损伤中已探明的病理生理机制,建立缺氧损伤神经细胞模型,观察其对缺氧PC12细胞损伤模型细胞形态学、存活力及上清液中PAF含量的影响,探讨补阳还五汤含药血清对缺氧损伤PC12细胞的保护作用,为进一步研究该方神经细胞损伤保护作用,反映该方对神经细胞损伤过程的多环节干预,筛选出对神经细胞损伤有保护作用的有效成分提供实验依据。
　　 目的:探讨补阳还五汤含药血清对缺氧损伤PC12细胞的保护作用。
　　 方法:1、实验动物、分组及模型建立:普通级新西兰兔6只,随机分为:正常组2只(蒸馏水组)、含药血清组2只(补阳还五汤组)、阳性对照组2只(金纳多组):每组动物分别给予相同体积10ml/kg灌服,1次/d,连续7 d。
　　 2、标本的采集及研究方法:末次给药前禁食12 h,给药2h后采血(耳中央动脉)制备含药血清。将已80％融合的PC12细胞分为6组,补阳还五汤(BYHWD)含药血清高剂量组(10％),补阳还五汤(BYHWD)含药血清低剂量组(2.5％),阳性对照组(金纳多含药血清5％),空白血清组(正常兔血清5%),模型组(无兔血清),正常组(正常培养含牛、马血清各5％),按相应分组更换含药血清培养基。将已分组加药的PC12细胞置于37℃、5％CO2和90％氮气的三气培养箱内,制作缺氧模型。①PC12细胞形态学观察,缺氧1.5h,3h,18h后,用倒置显微镜观察细胞形态的变化,并用图像采集系统进行拍摄；②缺氧造模18 h后,MTV法检测细胞存活力；③缺氧造模1.5 h后,Annexin V/PI检测细胞凋亡率；④缺氧造模1.5 h后,酶联免疫法(Elisa法)检测培养上清PAF含量。
　　 结果:①对缺氧损伤PC12细胞形态学的影响:缺氧1.5h主要表现为急性损伤,与正常组相比,无论加药与否,在形态学表现上,均有细胞排列紊乱,胞体形态变异,多不规则,部分连接断裂,并伴部分脱壁,细胞间间隙变大。BYHWD组接近正常组细胞,缺氧18 h表现为细胞的自我修复,与模型组相比,细胞生长密集,加药各组均有不同程度的修复,胞体伸出突触,较正常组稍粗短,胞体间重新建立连接,但较正常组稍紊乱,但BYHWD组与金纳多组细胞形态接近正常组。②对缺氧损伤PC12细胞存活力的影响:各组细胞存活力相比有显著的统计学意义(F=69.671,P=0.000)。模型组的存活力与正常组相比下降,差异有显著性(P=0.000)；10％和2.5％BYHWD组存活力与模型组相比升高,差异有显著性(P值均=0.000)；5％金纳多组与模型组比较,差异有显著性(P=0.000)；10％BYHWD组和2.5％BYHWD组相比升高,差异有显著性(P=0.000)。说明补阳还五汤高低剂量组均能提高缺氧损伤的PC12细胞的存活力,高剂量尤为显著；③对缺氧损伤PC12细胞凋亡率的影响:结果表明,各组细胞凋亡率相比有显著的统计学意义(F=20.740,P=0.000)。模型组的凋亡率与正常组相比升高,差异有显著性(P=0.000)；10％和2.5％BYHWD组凋亡率与模型组相比下降,差异有显著性(P=0.000)；5％金纳多组与模型组比较,差异有显著性(P=0.000)；10％BYHWD组凋亡率比2.5％BYHWD组有下降趋势,但两组无差异(P=0.209)。说明补阳还五汤高低剂量组均能降低缺氧损伤的PC12细胞的凋亡率；④对细胞上清液中PAF含量的影响结果表明,各组细胞上清PAF含量相比有显著的统计学意义(F=7.990,P=0.000)。模型组的PAF含量与正常组相比升高,差异有显著性(P=0.000)；10％和2.5％BYHWD组PAF含量与模型组相比下降,差异有显著性(P=0.000；P=0.004),与5％金纳多组相比差异无显著性(P=0.314；P=0.983),10％BYHWD组PAF含量比2.5％BYHWD组有下降趋势,但两组无差异(P=0.329)。说明补阳还五汤高、低剂量均能降低缺氧损伤的PC12细胞上清的PAF含量。
　　 结论:补阳还五汤含药血清对缺氧损伤PC12细胞有明显的保护作用,其机制与降低缺氧损伤细胞PAF含量释放,从而保护细胞形态和提高存活力有关。