（文章篇）S3E9:lncRNA研究，做到什么程度才能发Cancer Cell?

大家好，在前面我们介绍了分子机制研究的三种模式：表达、活性和定位，又分别从蛋白翻译和蛋白降解两个角度，以文章为例说明了lncRNA在调控蛋白表达中所起的作用，今天我们说的主题是活性。

我们在第一季里面介绍过蛋白翻译修饰的一个方面：泛素化，说的是lncRNA通过介导蛋白的泛素化修饰变化影响蛋白降解最终调控蛋白表达水平。在诸多蛋白翻译后修饰中，除了泛素化修饰外，还有磷酸化、乙酰化、糖基化等等，昨天的文章讲的是Beclin1的乙酰化修饰在细胞自噬中的作用，今天我们选的角度是lncRNA如何影响蛋白的磷酸化来调控其活性。

今天我们分享的文章是这篇：A cytoplasmic NF-κB interacting long noncodingRNA blocks IκB phosphorylation and suppresses breast cancer metastasis. Cancer Cell . 2015 Mar 9.  Cancer Cell， Cell 子刊，影响因子24， 是我们讲过的文献里面最高的了，这篇文章里面涉及到我们以前讲过的点非常多。

讲之前还是简单介绍下背景。

上面是NF-kB信号通路图，黄色圆圈是本文中涉及到的分子。NF-κB为一个转录因子蛋白家族，包括5个亚单位:Rel (cRel)、p65 (RelA, NF-κB3)、RelB和p50(NF-κB1)、p52(NF-κB2)，NF-κB信号通路是联系炎症与肿瘤的关键一环。IkB抑制NF-κB信号通路，而炎性因子刺激下IkB被IKK磷酸化，导致IkB被降解，所以NF-kB通路被激活，而NF-kB通路被激活后乳腺癌细胞侵袭能力增强。本文研究的就是lncRNA NKILA在这个过程中的作用。

先上机制图：

这篇文章的主角是lncRNA NKILA（NF-kB interacting long noncoding RNA），讲的主题有四个：

1.  NKILA直接阻断了IkB 的磷酸化；

2. NKILA与NF-kB/IkB直接结合，三者形成复合物；

3. NKILA是NF-kB的负反馈调节因子；

4. 侵袭性乳腺癌中NKILA的低表达预示病人预后差。

因为这篇文章实在有些烧脑，所以我们打算不按照以上四个主题来分析，而是分成下面五部分来讲。

1. lncRNA NKILA的发现与鉴定。

在前面“（文章篇）S3E7：一文掌握lncRNA研究的套路和创新点”中，我们总结了鉴定lncRNA要做的八件事情，

我们看看作者在鉴定lncRNA NKILA时做的工作：

以上八部基本都涵盖了。

2. lncRNA NKILA的上下游表达调控机制。

在第一部分实验中，作者发现炎性细胞因子刺激下 lncRNA NKILA表达上调，我们在”（策略篇）环环相扣：高分文章机制研究的秘诀“和“（策略篇）反馈回路：基金和文章装逼利器” 中提到过，在做机制研究的时候，高分文章一般采用两种乃至多种研究模块，比如说，做一个分子的机制，不仅要做这个分子的下游，还要做上游的机制。那么我们看对应这个分子 lncRNA NKILA，它的上下游是什么样的呢？

我们先说结论：

•  lncRNA NKILA 被NF-kB转录激活，生成的多了，所以表达上升；（上游1）；

•  lncRNA NKILA 被miR-103/miR-107迅速降解，所以下降迅速；（上游2）

•  lncRNA NKILA 降低了NF-kB的活性；（下游1）

•  lncRNA NKILA 抑制了TNF-a诱导的P65核转位（下游2）；

上游机制：既影响 lncRNA NKILA 产生，又影响 lncRNA NKILA 降解；

下游机制： lncRNA NKILA既影响NF-kB活性，又影响P65的定位；

 而且，上下游结合起来又形成了负反馈回路！

下面我们挑着看上下游这四点研究内容：

A. NF-kB转录激活NKILA，用的方法就是是我们说过的CHIP、荧光素酶报告基因和EMSA；

B. miR-103/miR-107下调 lncRNA NKILA 表达：

C和D. lncRNA NKILA 降低了NF-kB的活性，并抑制了TNF-a诱导的P65核转位：

看到这里，大家应该对机制研究初步有些感觉了吧，不过对这篇文章来说，才刚刚开始哦。

3.  lncRNA NKILA降低NF-kB活性机制：

 lncRNA NKILA 通过与NF-kB:IkB复合物直接结合，抑制IkB的磷酸化，验证 lncRNA NKILA 与NF-kB:IkB复合物的直接作用还是RIP和RNA Pulldown。

4.  lncRNA NKILA抑制IkB磷酸化方式确定：

在上一部分，作者发现 lncRNA NKILA 通过与NF-kB:IkB复合物中p65直接结合，通过抑制IkB的磷酸化，从而下调NF-kB通路的活性。那么， lncRNA NKILA与p65直接结合的序列是什么？p65与 lncRNA NKILA结合的结构域是什么？各自发挥怎样的作用？ 

虽然只放了四张图，不过这一部分还是挺复杂的，前期研究发现，IkBα可以使NF-kB从下游调控基因的DNA上分离，因此推测NF-kB:IkBa:DNA三者复合物可能是不稳定的。

• 作者通过对lncRNA NKILA进行结构预测、RNA Pulldown等实验首先明确lncRNA NKILA里面有hairpinA和B两个茎环结构，而且两者对于NKILA:NF-kB:IkBa三者复合物的作用是不同的：hairpinA模拟了NF-kB的DNA结合序列，也确实结合了NF-kB，而hairpinB则抑制了IkBα导致的lncRNA NKILA:NF-kB分离，从而提高了NKILA:NF-kB:IkBa三者复合物的稳定性。

• 然后，下面是对p65与 lncRNA NKILA结合关键位点的确定，又通过RIP等实验结果发现：p65中S51-R73氨基酸是与hairpinB结合的关键位点。

这样，lncRNA NKILA与p65之间结合作用的序列、位点、功能就讲差不多了，下面是lncRNA NKILA抑制IkB磷酸化的具体机制研究。

• 首先考虑的是：lncRNA NKILA抑制IkB磷酸化，是lncRNA NKILA让IKK不能磷酸化IkB呢，还是增加IkB的去磷酸化呢？结果发现是第一种：lncRNA NKILA通过覆盖IkB的磷酸化位点，使得IKK不能磷酸化IkB；

• 然后进一步发现hairpinC是覆盖IkB的磷酸化位点的关键位置。

• 最后结合上面论证过的提到的hairpinA、B的功能，总结lncRNA NKILA抑制IkB磷酸化方式：NKILA中hairpinA结合NF-kB，hairpinB抑制了IkBα导致的lncRNA NKILA:NF-kB分离，hairpinC覆盖IkB的磷酸化位点，即一个lncRNA NKILA的三段序列分别发挥了结合、维持和阻碍的三重作用。

我们认为这一部分和第二部分是这篇文章中机制部分最难，不过也是最出彩的地方，为了尽量让大家看清晰一些，我们只挑了重点来说明，大家可以好好看下这两部分，特别是层层递进的关系和严密的逻辑性。

5.  lncRNA NKILA抑制肿瘤转移的功能实验；

这一部分应该是文章中最轻松的地方了，包括了细胞、动物和临床样本三部分实验，临床部分有表达差异、与样本病理参数的相关性，与病人预后的关系。

文章讲到这里就差不多了，大家可以看到一篇Cancer Cell要求的工作量，特别是对机制要求的深度了，只能膜拜！

That’s all. Thank you!

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