作者通过数据库分析发现,DSCAM-AS1与肿瘤进展、他莫昔芬耐药、乳腺癌分级、转移等显著正相关,与乳腺癌预后良好相关基因呈负相关。
作者为了研究DSCAM-AS1在雌激素受体阳性乳腺癌细胞系中角色,选择MCF7以及T47D两种雌激素受体阳性细胞,构建了DSCAM-AS1稳定敲减细胞系。
DSCAM-AS1稳定敲减细胞系中,细胞增殖能力降低,侵袭能力减弱,克隆形成细胞数目减少。
为了进一步研究DSCAM-AS1与肿瘤进展关系,作者选择表达DSCAM-AS1能力中等的两株雌激素受体阳性细胞系T47D与ZR75-1,进行DSCAM-AS1稳定过表达,研究发现细胞侵袭能力增强。
体外裸鼠成瘤实验证明,敲减DSCAM-AS1后,肿瘤肝转移能力降低。
作者通过pull-down技术,筛选出与DSCAM-AS1结合的蛋白质-hnRNPL,并通过RIP技术进行了进一步的确认,证实了DSCAM-AS1与hnRNPL的特异性结合。
为了研究DSCAM-AS1与hnRNPL的作用机制,作者进行了功能挽救实验:过表达DSCAM-AS1,同时敲减hnRNPL,研究发现敲减hnRNPL可以逆转细胞侵袭能力增强的现象。
作者进而探究DSCAM-AS1与hnRNPL是否存在结合位点,首先是DSCAM-AS1序列上发现了hnRNPL特异结合的CACA富集区;进而通过构建DSCAM-AS1不同区域突变亚型,通过RNA pull-down实验确认DSCAM-AS1与hnRNPL的结合位点位于DSCAM-AS1CACA富集区。
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