没有CT值，我的QPCR实验失败了吗？（上）

“为什么我的实验没有CT值？”

“是我的实验/试剂/引物/仪器/操作有问题吗？”

“我的实验必须要重做吗？”

作为技术支持的小编，经常碰到客户问类似的问题。小编也理解，对于做荧光定量实验的老师们而言，C_T值是一个非常重要的数据，有时候大家忙活半天就是为了得到一个C_T值。而实验做完却没有C_T值，的确是很让人郁闷的情况。但是导致没有C_T值的原因不仅仅是实验失败，今天，小编就给大家总结一些常见的导致荧光定量结果没有C_T值的原因，希望能对大家有所帮助。

在解释为什么会没有C_T值之前，让我们先看一看C_T值是什么，它又是怎么产生的。

■  C_T值的全称是threshold cycle，指的是扩增曲线的荧光值达到阈值线时的循环数，它能反映起始模板的浓度，所以是荧光定量实验的重要数据。

那么C_T值是怎么产生的呢？荧光定量软件会对扩增反应的荧光曲线进行分析，画出基线（baseline）和阈值线（threshold）。基线通常是从循环最初信号稳定以后画到扩增曲线起峰前，代表了反应孔的背景荧光信号，图1中A图就标出了扩增曲线的基线位置。画基线的目的是为了扣除基线，如果把扩增反应比作一场跑步比赛，阈值线是终点的话，那就需要把起点也拉到同一位置才有可比性。因此，我们看到从A图到B图，图谱的纵坐标轴从Rn变成了ΔRn，起始循环的数值也从800左右变成了0，就是扣除了基线的结果。在扣除了基线的图谱上（图1B），软件画出一条穿过扩增曲线指数增长期与横坐标轴平行的线就是阈值线了，这条阈值线与扩增曲线相交，就产生了C_T值。

图1  扩增曲线中的重要概念

解释完了C_T值是如何产生的，接下来我们就通过几个案例来分析一下造成定量数据没有C_T值的原因。因为除了C_T值，扩增曲线图也是大家分析定量PCR数据时第一眼就会关注到的结果，所以我们就按扩增曲线图的情况来分类进行解释。

情况一：

没有扩增曲线图的选项

案例1：

在这个案例中，实验结果只有熔解曲线图，而没有扩增曲线图（图2A），数据结果中也没有C_T值这一栏。而客户的反应程序设计中循环扩增反应和熔解曲线的程序都没有问题（图2B），那么问题出在哪里呢？

图2 结果分析中没有扩增曲线图谱

我们再回到实验设置的界面（图3），会发现这里错把实验类型选成了Melt Curve，这就导致实验结果中只有熔解曲线图而没有扩增曲线图了，没有扩增曲线也就没法分析C_T值了。

图3 实验类型选择错误

因此，对于需要看C_T值的定量实验，需要选择Quantitation的实验类型，可以根据实验情况选择是绝对定量还是相对定量，但一定不能选择Melt Curve, Genotyping以及Presence/Absence这几个实验类型，否则就得不到C_T值的结果了。而且这种选择错误在实验结束后也无法再更改，这个实验就无法挽救只能重做了。

情况二：

扩增曲线图是空的

当实验类型选择正确以后，就能看到扩增曲线图谱的选项，但有的时候会发现这个图竟然是空的，这又是什么原因造成的呢？我们来看接下来的这几个案例：

案例2：

在这个案例中，实验结束以后，扩增曲线图里是空的，没有任何曲线（图4A）。但查看发现这个实验的设置没有任何问题，实验也是正常运行结束的，只是结束以后未点击分析，只要点击软件右上角的“Analyze”键后，就出现了正常的扩增曲线和C_T值（图4B）。

图4 实验结束后未分析导致扩增曲线图为空

所以，大家以后如果遇到这样的情况，第一反应是可以点一下“Analyze”键，看看是不是就会出现分析结果。另外，如果在对软件设置做了修改以后，也需要再点击“Analyze”键，才能把修改应用到分析中。

但有的时候点击了“Analyze”键，也不能出现正常的扩增曲线和C_T值，反而会出现一些报错的提示，那么就可以根据这个提示去修改对应的设置。

案例3：

在这个案例中，点击“Analyze”键后，软件提示“The analysis cannot proceed because the experiment is missing required plate setup information. Go to Experiment Setup to create and assign targets and samples”（图5A），这也就是说实验缺少必要的plate setup信息，需要回到设置界面去Define和Assign “targets”和“samples”。当我们回到设置界面，会发现这个实验虽然设了target，但没有给孔分配target（图5B）。由于软件计算阈值线的时候是按target来画的，所以没有设置或分配targets会导致软件无法进行分析，从而得不到C_T值。

图5 未设置target导致扩增曲线图为空

除了targets以外，如果是没有设置或分配samples，软件也会给出相同的报错提示，这里就不另外配图了。对于这两种情况导致的数据无法分析，只需要回到设置界面重新设置和分配好“targets”和“samples”，再回到分析界面重新分析就可以了。

其实扩增曲线图如果是空的，一般都是软件设置错误或者操作不当引起的，但这些设置错误有些在实验完以后可以修改，有些则无法挽救，比如下面这个案例。

案例4：

实验结束点击分析的时候，软件出现报错：“Analysis failed due to: GEx Session doesn’t exist in context”（图6A）。查看运行程序设置的时候发现在循环扩增的步骤没有采集荧光信号（图6B），这样自然就没有扩增曲线和C_T值了。同时，由于反应已经运行完毕，没有采集到荧光信号也无法通过后期的修改来补救，只能重新做实验了。

图6 未采集荧光信号导致没有扩增曲线

其实，在我们的荧光定量软件里默认的运行程序中，循环中退火延伸步骤是默认采集荧光信号的，所以大家如果要修改默认程序，一定要注意采集信号的图标是否是点亮的。

以上几个案例中，没有C_T值的原因都是由于没有扩增曲线导致无法计算C_T值，还有一些案例是有扩增曲线，但没有C_T值的。由于篇幅关系，小编把这些案例放到了下一篇里，请大家继续关注我们，期待《没有C_T值，我的QPCR实验失败了吗？（下）》。