摘 要：为探讨爱乐新与不同PRRSV活疫苗免疫影响开展本试验。选取35只蓝耳双阴性（抗体阴性，抗原阴性）5-6周龄仔猪，将其随机分为7组（A、B、C、A1、B1、C1、D），每组5只，用药+免疫组A、B、C组添加爱乐新，连续饲喂21天，饲喂剂量160ppm；免疫不添加药物组A1、B1、C1组正常饲喂；D组为空白对照组。A和A1组免疫VR2332株蓝耳苗；B和B1组免疫TJM-F92株蓝耳苗；C和C1组免疫JXA1-R株蓝耳苗。对仔猪在免疫后第0、1、3、5、7、10、14、21和28天(day, d) 血清样本检测PRRSV抗原、抗体和细胞因子CD4、CD8、IL-1β、TNF-α和 IFN-γ。结果表明，用药+免疫组蓝耳病毒血症持续时间短于免疫不添加药物组，病毒血症水平低于未用药组；爱乐新可使PRRSV疫苗抗体提早产生、对中和抗体水平无明显影响。相同时间点的促炎因子IL-1β与肿瘤致死因子TNF-α的浓度用药组均低于未用药组；干扰素 IFN-γ的浓度高于未用药组；用药组与未用药组细胞因子CD4，CD8结果全为阴性，无差异。
关键词：爱乐新；PRRSV活疫苗；PRRSV病毒血症；PRRSV抗体；细胞因子
猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS ) 又称为猪蓝耳病，是一种高度接触性传染病，呈地方流行性。蓝耳病病毒 (PRRSV) 只感染猪，各种品种、不同年龄的猪均可感染，但以妊娠母猪和1月龄以内的仔猪最易感[1,2]。患病猪和带毒猪是本病的重要传染源。该病的主要传播途径是直接接触感染、空气传播和精液传播，也可通过胎盘垂直传播。易感猪可经口、鼻腔、肌肉、腹腔、静脉及子宫内接种等多种途径感染病毒，猪感染病毒后2～14周均可通过接触将病毒传播给其他易感猪[3-6]。从病猪的鼻腔、粪便及尿中均可检测到病毒。易感猪与带毒猪直接接触或与污染有PRRSV的运输工具、器械接触均可受到感染。感染猪的流动也是影响本病传播的重要因素[7-8]。
PRRSV可通过干扰正常的抗原递呈和T淋巴细胞的活化来抑制机体免疫反应，TNF-α和 IFN-γ是重要的先天性细胞因子。IFN-γ分泌型细胞主要是 CD4+CD8+细胞，可诱导细胞产生多种抗病毒蛋白，诱导MHC分子表达，促进抗病毒免疫。分泌型 IFN-γ是机体粘膜防御系统的主要成分，覆盖在鼻、咽、气管、肠和膀胱粘膜的表面，它能抑制微生物在呼吸道上皮附着，减缓病毒繁殖，是黏膜重要屏障，对某些病毒、细菌和一般抗原具有抗体活性，是防止病原体入侵机体的第一道防线[9]。PRRSV的感染会引起这些细胞因子表达的上调。PRRSV的感染也会促进促炎细胞因子的释放，IL-1β是免疫应答和炎症反应的基本要素和致热源，在介导机体免疫应答、炎症反应和消除病原体方面具有重要意义[10-11]。
近年来本实验室从公猪精液和流产胎儿中检测出PRRSV疫苗毒，且疫苗毒的比例不断升高，说明PRRSV疫苗毒也会垂直传播，这提示我们目前PRRS的防控不仅仅只针对PRRSV野毒，PRRSV活疫苗的使用也应该谨慎。
国内外有研究表明大环内酯类抗生素-泰万菌素（商品名：爱乐新）[12]具有抑制PRRSV野毒体内外复制的作用，表现为爱乐新可缩短PRRSV病毒血症，可减少猪场PRRSV毒株种类，可控制PRRSV垂直传播，针对于爱乐新对PRRSV野毒的这些效用，设计本试验来研究爱乐新对不同蓝耳苗的免疫效果的影响。
1. 材料与方法
1.1 材料
100g:20g 爱乐新批号20170402 上海伊科拜克兽药销售有限公司提供
PRRSV活疫苗 PRRS VR2332株疫苗，购自某商品疫苗公司
PRRS TJM-F92株疫苗，购自某商品疫苗公司
PRRS JXA1-R株疫苗，购自某商品疫苗公司
PRRSV荧光定量PCR检测试剂盒批号20170906 购自北京亿森宝生物科技有限公司
PRRSV N蛋白抗体检测试剂盒 IDEXX批号K371
PRRSV G蛋白抗体检测试剂盒 PrioCHECK 批号 PR170401L
MARC145细胞 由上海创宏生物科技有限公司提供
新生牛血清批号20170105 购自浙江天杭生物科技股份有限公司
DMEM培养液批号20170301 购自浙江天杭生物科技有限公司
PRRSV野毒CH15株由上海创宏生物科技有限公司分离鉴定
DNA提取试剂盒批号 20170801 购自北京天根生化科技有限公司
细胞因子试剂盒 批号 20170901购自北京祥龙环宇生物技术有限公司，美国BioXL试剂盒
试验猪上海交大七宝试验猪场，35头仔猪， 5～6周龄，经PRRSV RT-PCR检测试剂盒检测为蓝耳病病毒抗原阴性、PRRSVELISA抗体检测试剂盒检测为蓝耳病病毒抗体阴性。
1.2 方法
1.2.1 饲喂与免疫方案
用药组饲喂爱乐新7 d后每头猪免疫PRRSV活疫苗1头份，再继续饲喂爱乐新14 d，共饲喂21d，浓度为160 ppm。
1.2.2 分组与用药方案
1.2.4 病毒检测荧光定量PCR法检测血清样本中PRRSVORF7的病毒含量，详细步骤参阅产说明书。1.2.3 样品采集仔猪在接种疫苗后第0、1、3、5、7、14、21和28d 采血，分离血清立即-20℃储存待测。
1.2.5 抗体检测ELISA试剂盒检测N蛋白抗体和G蛋白抗体；使用固定病毒-稀释血清法检测PRRSV中和抗体。
1.2.6 细胞因子检测ELISA试剂盒检测血清样本中IL-1β，TNF-α，IFN-γ，CD4，CD85个指标，详细步骤参阅产品说明书。
2 结果与分析
2.1 PRRSV病毒血症检测结果按不同毒株各自分析
仔猪在免疫后第0、1、3、5、7、14、21和28 d采集的血清样本进行PRRSV荧光定量RT-PCR检测。如图1所示，用药组与未用药组第3和5 d血样的PRRSV病毒含量最高，随着采血时间的递增，PRRSV病毒含量逐渐降低，用药组较未用药组降低快，使用Prism5.0做图及数据分析软件表明第3、5、7和28 d A组和A1组PRRSV病毒含量差异极显著（P 0.001）；第3和5 d B组和B1组PRRSV病毒含量差异极显著（P 0.001）；第3 d C组和C1组PRRSV病毒含量差异极显著（P 0.001），说明用药组PRRSV病毒血症持续时间较未用药组短，病毒血症水平较未用药组低。
采血时间（d）
采血时间（d）
采血时间（d）
采血时间（d）
图1仔猪血清PRRSV荧光定量RT-PCR结果
注：数据显示是均值±标准差，第3、5、7d和28d 采血时间Prism5.0数据分析显示A组和A1组: P 0.001, 差异极显著；第3和5d 采血时间B组和B1组: P 0.001，差异极显著；第3 d采血时间C组和C1组: P 0.001，差异极显著。 n=5。
2.2 PRRSV抗体检测结果
分别使用IDEXX和PrioCHECK PRRSV ELISA抗体检测试剂盒对0、1、3、5、7、14、21和28 d血清样品PRRSV N蛋白和G蛋白抗体进行检测。检测结果见图2和图3，结果表明PRRSV N蛋白抗体在第10 d产生，G蛋白抗体在第14 d产生，PRRSV N蛋白抗体的产生早于G蛋白抗体；相同采血时间检测结果显示用药组抗体产生时间早于未用药组。
图2仔猪血清PRRSVN蛋白抗体阳性率
图3仔猪血清PRRSVG蛋白抗体阳性率
2.3 PRRSV中和抗体检测结果
使用固定病毒-稀释血清法对0、1、3、5、7、14、21和28 d血清样品进行PRRSV中和抗体的检测。结果见图4，结果表明疫苗免疫后21d可检测到中和抗体，相同采血时间用药组PRRSV中和抗体效价与未用药组并无明显差异。
图4仔猪血清PRRSV中和抗体效价
2.4 细胞因子检测结果
仔猪在第0、1、3、5、7、14、21和28 d采集血进行细胞因子检测。如图5和6所示，随着采血时间的递增，IL-1β和TNF-α两指标呈现上升趋势，但用药组较未用药组数值低。使用数据分析软件表明第28 d B组和B1组、C组和C1组IL-1β细胞因子浓度差异极显著（P 0.001）；第10、14和28 d A组和A1组TNF-α细胞因子浓度差异极显著（P 0.001）；第1、5、7、10、14和28 d B组和B1组TNF-α细胞因子浓度差异极显著（P 0.001）；第21和28 d C组和C1组TNF-α细胞因子浓度差异极显著（P 0.001）。
图5 仔猪血清IL-1β细胞因子检测结果
采血时间（d）
图6仔猪血清TNF-α细胞因子检测结果
仔猪在第0、1、3、5、7，14，21，28 d采集血进行CD4、CD8和 IFN-γ细胞因子检测。如图7所示，相同采血时间用药组 IFN-γ浓度高于未用药组，使用数据分析软件表明第1、5、7、10、14和28 d A组和A1组IFN-γ细胞因子浓度差异极显著（P 0.001）；第21 d C组和C1组IFN-γ细胞因子浓度差异极显著（P 0.001）；第10、14和28 d B组和B1组IFN-γ细胞因子浓度差异极显著（P 0.001）。
图7仔猪血清IFN-γ细胞因子检测结果
如表2和表3所示，用药组和未用药组CD4与CD8指标检测结果均为阴性，无差异。
3 讨论
本研究比较了猪饲喂爱乐新与接种不同PRRSV活疫苗后血清中病毒血症、抗体水平和重要细胞因子表达水平的差异，目的在于研究爱乐新对不同PRRSV活疫苗的免疫影响。
PRRSV通过呼吸道黏膜和生殖道黏膜上皮进入猪体内，在鼻腔黏膜、呼吸系统的巨噬细胞和淋巴细胞中完成最初的复制，随后进入血液循环和淋巴循环，导致病毒血症的产生和感染，其主要感染巨噬细胞，肺泡巨噬细胞（PAM）是急性感染PRRSV复制的主要位点，是肺部最早接触病原微生物的免疫防御细胞之一，在肺部的防御体系中起重要作用。其是机体的重要免疫细胞，在非特异性免疫方面，PAM主要通过吞噬作用杀灭和清除病原体及异物，介导炎症反应；在特异性免疫方面，PAM具有免疫调节功能，抗原递呈、分泌各种细胞因子等[13]。
细胞免疫在抗PRRS感染中发挥重要的作用，而爱乐新的加入可以调节机体细胞免疫反应。本试验发现使用爱乐新可以缩短PRRSV病毒血症、加快PRRSV抗体的产生、促进细胞因子免疫调节。IL-1β是一个关键的促炎细胞因子，其作用强弱由局部浓度决定。早期感染时IL-1β的表达可能有助于促进细胞的免疫功能和机体对感染发挥有限的免疫应答，但也可能会引发炎症反应，对机体造成损伤。TNF-α主要由单核巨噬细胞产生，主要功能是：诱导敏感细胞凋亡；抑制造血，促进炎症，增强细胞免疫，抑制体液免疫；促进粘附分子表达，调节激素和多种细胞因子产生等[14]。PRRSV活疫苗免疫后，IL-1β，TNF-α细胞因子浓度呈上升趋势，但用药组所诱导的IL-1β，TNF-α水平低于未用药组，说明爱乐新可以抑制机体可能产生的炎症反应，促进免疫应答，这可能与爱乐新本身具有的抑炎性作用有关。
外周血的T淋巴系统在机体的抗病毒感染中发挥着重要的作用，CD4和CD8细胞因子可协同T细胞分泌的细胞因子对机体免疫进行调节， IFN-γ表达的上升和下降也与机体的免疫调节相关[15]。本试验结果显示添加爱乐新用药组 IFN-γ细胞因子的浓度均高于未用药组，说明爱乐新可促进机体产生更快更强的免疫反应，促进抗原呈递。本试验中细胞因子CD4、CD8的检测结果都为阴性，用药组和未用药组无差异，说明爱乐新的添加对这两个因子无影响。
本试验结果显示添加爱乐新用药组可加快PRRSV疫苗抗体的产生，但对中和抗体效价无明显影响。
持续性感染是PRRSV的重要特点之一，正因为病毒的持续性存在，可能会使局部的免疫受到抑制，且PRRSV抗原差异性较大，具有快速变异的特征。因此免疫猪体内PRRSV的检测可反应病毒血症的持续时间。本试验结果显示用药组可缩短PRRSV病毒血症的持续时间，降低PRRSV病毒血症水平。用药组中免疫TJM-F92株的B组PRRSV病毒含量最低；未用药组中免疫JXA1-R株的C1组PRRSV病毒含量最低，各活疫苗之间的差异可能与不同疫苗本身的作用机制有关。
有研究发现攻毒后机体病毒血症及细胞因子会发生更具差异性的免疫应答，根据毒株的类型及毒力表现为病毒血症的强弱，持续时间的长短及细胞因子的浓度升降，这也将是我们进一步的研究方向。
4 结论
4.1 爱乐新可缩短PRRSV疫苗毒病毒血症持续时间，可降低PRRSV疫苗毒病毒血症水平。
4.2 爱乐新可加快PRRSV疫苗抗体的产生、对中和抗体效价无影响。
4.3 爱乐新可降低PRRSV疫苗免疫引发的炎症反应，促进免疫应答。
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