基因组非编码区变异的临床解读建议（下）

基因组非编码区变异的临床解读建议（上）

基因组非编码区变异的临床解读建议（中）

示例变异校准

NF1:c.-160C>1 型神经纤维瘤病个体中鉴定的变异

NF1:c.-160C>A (ENST00000356175.7; chr17:31095150:C>A GRCh38)变异在NF1基因的5′UTR上产生了一个上游起始密码子（uAUG）。尚未在 ClinVar 或文献中报道。先前已证明 NF1 中产生 uAUG 的变异会导致神经纤维瘤病。该变异与这些先前确定的致病性变异具有相同的预测影响：它被创建成一个强  Kozak consensus，并且从该 uAUG 的翻译将创建一个上游开放阅读框 (uORF)，其与原起始站点编码序列的发生框移。因此，我们将应用 PM5。该变异在gnomAD中也不存在（PM2_Supporting），鉴于NF1表型对NF1基因的特异性，如果在具有典型神经纤维瘤病（NF1）特征的个体中发现该变异，应用PP4是合适的。如果这个变异是新发的（PM6/PS2），或者有证据表明它与疾病有中等程度的共分离（PP1_Moderate），它将达到可能致病的分类。类似地，在经过验证的细胞系模型中证明翻译减少或适当组织样本中蛋白质水平降低的功能测定将能够应用 PS3，从而导致可能致病性或致病性分类。

CFTR c.3874-4522 A>G 在囊性纤维化患者中发现

先证者被诊断为囊性纤维化（16-20 岁）。先前的基因检测发现了杂合状态下 CFTR 中常见的 c.1521_1523delCTT (p.Phe508del; chr7:117559590:ATCT>A GRCh38) 致病性变异，并被证明与c.3874-4522A>G (chr7:117648320:A >G; PM3) 是反式。c.3874-4522A>G在gnomAD（PM2_Supporting）中不存在，在分析时，以前曾在一个囊性纤维化的单一病例中报道过，没有其他功能证据。有很强的表型-基因型相关性（PP4）。MaxEntScan 支持激活一个隐秘的剪接位点，但许多计算机剪接工具不支持该变异会影响剪接（SpliceAI、TraP），因此，PP3 和 BP4 均未应用。使用从全细胞血液中提取的RNA对剪接影响进行了功能评估，显示CFTR的剪接异常，引入了一个含有终止密码子的125bp隐性外显子。因此，我们采用了PS3_Strong，因为我们使用的是一种既定的剪接变异调查方法，并有适当的对照。由于我们使用的是PS3，如果使用这个代码，我们将不得不在最终分类中排除PP3。该变异被归类为可能致病的变异（PS3_Strong, PM3, PM2_Supporting, PP4）。

新证据的出现

初步分类后，从文献中获得了额外的证据。这包括来自minnigene和患者样本的功能证据。由于在初始分类中进行的分析适用于 PS3_Strong，因此没有因该证据而改变。据报道，来自多个种族的其他囊性纤维化家族也携带 c.3874-4522A>G 变异，并且在其中至少 4 个家族中，有症状的个体被证明携带 c.3874-4522A>G 与已证实的致病等位基因呈反式，这一证据使我们能够将PM3 升级为 VeryStrong，并将我们的最终分类升级为致病性（PS3_Strong、PM3_VeryStrong、PM2_Supporting、PP4）。

在无虹膜患者中发现 PAX6 远端增强子变异

chr11:31664397 C>A (GRCh38) 变异位于 PAX6 下游的候选 CRE 和ELP4 的内含子中。该区域高度保守，该元件被 ENCODE 识别为“远端增强子”（在 UCSC 基因组浏览器上可视化）。功能实验表明，该元素的缺失会破坏PAX6的表达维持。多个计算得分支持一个有害的作用（CADD = 17.4；ReMM = 0.985；FATHMM_MKL = 0.993；PP3），并且该变异在gnomAD中不存在（PM2_Supporting）。计算模型表明，该变异破坏了PAX6的结合位点，这一点通过破坏晶状体中的报告表达而得到验证（PS3_Moderate）。该变异还通过trio分析为新发突变（PS2），在一个具有高度特异性表型的患者身上被鉴定出来（PP4）。总而言之，这些数据导致可能致病性分类（PS2、PS3_Moderate、PM2_Supporting、PP3、PP4）。

讨论

在这里，我们概述了将 ACMG/AMP 指南改编为基因组蛋白质编码区域之外识别的变异的变异解释的注意事项。这些建议已由专家小组仔细审查和完善，并由临床变异科学家进行广泛测试。

很明显，我们对非编码区变异对罕见病影响的了解是一个快速发展的领域，这使得提供适合所有可能情况的综合指导变得复杂。因此，我们试图提供可应用于大多数变异类型的一般指南，并包含了如何在实践中应用该指南的具体示例。我们希望这些建议能够增加对非编码区变异的解释，并促进发现更多致病变异类型的例子，这反过来将为本指南的进一步修订提供信息。为了能够持续学习和完善这些指南，我们鼓励共享变异数据，包括最初未被归类为致病性的变异，例如通过向 ClinVar 提交分类变异并允许通过 DECIPHER访问个人级别数据。

在测试这些指南的过程中，很明显，广泛采用的最大障碍之一是获得表观基因组数据（例如，定义候选调控元素）和解释非编码区变异所需的计算预测工具。我们迫切需要可访问的工具，以允许不精通生物信息学的个人更好地可视化这些数据，理想情况下允许按细胞类型/组织进行查询，以允许对这些数据进行透明的管理和可重复的解释。我们还需要更多的研究，旨在破译完整的“调控代码”，并为未在有限的已知致病变异库上训练的非编码变异开发计算机预测工具。反馈还清楚地表明，围绕使用指南的各个方面，人们对教育网络研讨会和研讨会有很大的兴趣，这包括寻找和评估可能使用不熟悉的分析的功能数据的培训。我们正在积极参与开发这些，希望它们能够提高可用性和采用率。

迄今为止，我们对非编码区变异在罕见疾病中的作用的理解的一个实质性障碍是，在搜索不同调控区域和/或变异类别之间的变异富集时，缺乏统计能力。这是由于多种因素造成的，包括（1）大多数非编码区变异几乎没有影响或影响很小，（2）对于如何细分基因组以进行全基因组扫描缺乏明确性，（3）潜在的相反作用和（4）缺乏来自不同遗传祖先群体的大规模全基因组测序数据集以及相关的表型数据。行业需要使用系统和可重复的分析方法（包括基于区域的变异过滤）对具有表型特征的大型 WGS 队列进行研究，以确定非编码区域变异对诊断产量和临床效用的总体贡献。相反，迄今为止，我们在识别非编码区致病变异方面的成功，大部分是利用表型上高度选择的队列，其中只有一个或极少数的基因被怀疑涉及。这种方法可能会继续成功地识别非编码区的新致病变异。

非编码区的变异引起和促成遗传病风险的全部机制仍然是未知的。然而，许多调节性变异的影响可能比影响蛋白质序列的变异小，而且这些影响可能具有高度的组织特异性。虽然对于一些对剂量极为敏感的基因，即使是部分效应变异也会导致严重的疾病（如 MEF2C 所示）；在其他情况下，仅具有中等影响的单个变异将不会产生足够的有害性，或者可能只会在单个组织或器官中引起疾病。这些变异体的外显率可以被其他等位基因的相对表达所改变，或者调节性变异体本身可以改变破坏性蛋白编码变异体的外显率，和/或只在与其他变异体结合时才引起疾病，业内需要进一步研究以充分阐明这些不同机制的频率和影响。

大多数非编码区变异预计会减少或增加受影响基因的蛋白质产物，无论是通过影响转录，还是转录后调节机制。因此，预计这些变异将主要影响对剂量敏感的基因。然而，也有例外，如5′UTR中的uAUG变异，在N端延长了编码序列，这可能对非剂量敏感的转录物产生负面影响。此外，在某些情况下，一个基因似乎并不受到编码功能缺失变异的限制（所以可能不被认为是单倍剂量不足），但降低蛋白水平的调节变异可能是有害的。例如，如果一个补偿机制依赖于触发无义介导的衰变的蛋白截断变异，就可能是这种情况。

鉴于预测大多数非编码区变异的效果和下游影响的不确定性，这些建议是偏保守的，往往降低了适用于个别规则的证据强度（如PM1）。我们承认，新发现的变异体因此很难达到可能致病的分类。

在这些指南中，我们主要讨论了影响现有调控区域的变异；然而，也有通过创造新的调控元素而致病的变异的例子。例如，最近的一篇论文讨论了一个SNV，它创造了一个新的启动子，导致人类α-球蛋白位点的基因调控失调。我们也没有详细讨论非编码基因中的变异；但是，我们注意到在这个积极研究的领域中发现的致病变异的例子。变异在创造新的调控元素和影响非编码基因方面的重要性将越来越被认可，确保这些指南继续适合这些变异类型将是未来修订的一个重要考虑。

应该认识到，非编码区可能非常大。5′UTRs平均只有197 bps，而3′UTRs平均与蛋白质编码序列的大小差不多（3′UTRs为1775 bps，蛋白质编码序列为1745 bps）。相比之下，内含子区域的平均组合大小比蛋白质编码序列大 34 倍（在所有 MANE Select v0.95 转录本中计算的区域长度）达到59,220 bps。因此，在搜索可能的致病变异时包括非编码区域会显着增加基因组搜索空间。我们在此没有建议降低适用于非编码区的新发变异的证据强度，但需要对这些不同区域的新发变异的相对比率进行更多的研究，以确定在未来修订这些指南时是否应考虑到这一点。

结论

随着我们对致病机制的了解，以及可用的表型关联测序数据和分析非编码区的MAVE数据集规模的扩大，我们充分解释非编码区变异在罕见和常见疾病中作用的能力将继续提高。随着我们获得可靠地理解和解释这些变异的能力，很可能应该重新考虑我们对许多基因和病症进行基因测试的标准 '编码优先 '策略，不仅通过使用WGS，而且还通过扩大目标Panel捕获的区域，包括标准化的社区定义的调控元件，在这些方面仍然比较合适。鉴于我们不断增加的知识，可能还有必要重新审视和解释最初被指定为 '研究用 '的变异。然而，这反过来又会促使越来越多的罕见病患者重新获得明确的基因诊断。