想做多重免疫荧光？
需要先思考这几个问题：
问题 1：你认得全动物园里的动物们吗，比如大鼠，小鼠，兔，山羊，绵羊，鸡，荷兰猪（豚鼠）？不同种属的抗体需闹清楚。
问题 2：你确定能分得清字母表并做得了十以内得加减法吗？有不同亚型鉴定的过的一抗，比如：IgG1， IgG2a， IgG2b， IgG2c，IgM， IgE 不知道怎能行？
问题 3：你确定能将动物和数字字母们对号入座，并找对门牌吗？有对应种属特异反应性的 Fab 二抗，比如：F(ab')2 Fragment（避免 Fc 反应性出现的非特异染色），Cross adsorbed（抗体纯化过程交叉吸附，避免物种交叉反应带来的背景）。
问题 4：你确定能将重峦叠嶂移出两山排闼吗？选择合适的荧光素，明辨激发光和发射光，且不会导致荧光背景增强，比如：FITC、PE、Cy、Alexa Fluor、DyLight。
就算上面的问题你都能搞定，订购来了各种试剂，准备来了片子，你就一定能染出来多重颜色？
你只是迈开了万里长征的第一步而已。因为要得到理想的荧光实验结果，每一个步骤都需深 (wā) 度 (kēng) 优 (mái) 化 (tǔ)，固定通透方法、浓度配比、抗体共孵育、抗体稀释液、封闭条件等等。
此时，有人在你发际线还没有升高，头发还乌黑浓密的时候，在你的耳边悄悄跟你说：做多重荧光简单，有种快捷省时的方法。
先让你们随意感受一下这种方法染出来的图片：
接下来我们将仔细介绍该方法实验原理和实验步骤。
多重荧光免疫组化（mIHC）实验原理
上述方法采用 TSA 技术 (Tyramide Signal Amplification™，酪胺信号放大技术)：简单来说，用该方法做多重免疫荧光是利用二抗上带有的 HRP（而不是直接偶联荧光素），来催化后续添加入体系的非活性荧光素。
荧光素在 HRP 和过氧化氢的作用下被活化，跟临近蛋白的酪氨酸残基共价偶联，使得蛋白样品与荧光素稳定结合。
然后微波处理，前一轮非共价结合的抗体被洗掉，共价结合的荧光素还留存在样品上。再换个一抗来第二轮孵育，周而复始。等到所有抗体孵育结束，荧光素都结合好后，最后去检测结果。
由于每次体系中都只有单一抗体孵育，因此无需担心抗体交叉反应，以及一抗二抗种属匹配问题，大大减少了实验设计时不同种属抗体选择匹配的限制。
也就是说，如果用 TSA 技术，同一张片子上所有的靶标都可以选用特异性高的兔单克隆抗体。搭配同一支抗兔的 HRP 二抗就可以进行实验，而且信号放大的倍数大大增强。
荧光法多重免疫组化，可同时进行五个颜色通道以上，这种情况下发射光谱会重叠，我们可以借助多光谱成像系统来解决这个问题。这是传统间接荧光法染色和显色法多重免疫组化所做不到的。而且还能真实反映关键蛋白的表达情况和相互之间的关系，从而极大地节约珍贵的样品。
使用 TSA 技术，你需要准备：
1. 严格验证的高特异性抗体：所有 CST 的 IHC-P 验证过的抗体都满足mIHC（多重荧光免疫组化）高特异性的要求。
2. HRP 偶联的针对一抗种属亚型特异的二抗。
3. 酪胺荧光素 (PerkinElmer, Thermo Fisher Scientific 等供应商)。
4. 多光谱成像系统 (PerkinElmer 等)。
四事具备，你就可以开始尝试进行 TSA 的多重荧光组化染色了。好炫的 mIHC 结果，比如：
或者：
如何做到呢？除了优质的抗体，还需要优化的实验方案和抗体配比，比如：如何配比抗体，如何选择荧光素等。
CST 研发科学家利用 CST 的优质抗体，在这个领域也花了很多功夫来尝试，强大的研发团队目前已经将已有方案优化到了 7 色！所以荧光染色染出七色光再也不是传说，七色光不是传说，不是传说！
而且实验方案、抗体配比全部免费开放给大家，免费开放，免费！下面容我直接带你们收获一下胜利果实吧，请看优化好的多重荧光免疫组化（mIHC）实验操作步骤：
多重荧光免疫组化（mIHC）实验操作步骤
首先，我们来解读一下 CST 采用的基于 TSA 的 mIHC 实验优化原则，我们以人浆液性卵巢癌的石蜡切片样本染 PD-L1、B7-H4、FoxP3、CD8alpha 和 CK 的 mIHC 优化流程为例介绍如何优化。
基本方法
1. 切片脱蜡、复水
2. 抗原修复：优化抗原修复流程，尽可能最大程度修复抗原。
3. 抗体浓度优化：染色前优化抗体稀释度，提高每一个靶点的检出率和信噪比。
4. 染色：用 SignalStain® Antibody Diluent #8112 稀释一抗，然后用对应的 SignalStain® Boost IHC Detection Reagent (HRP，Mouse) #8125 或 (HRP， Rabbit) #8114 作为二抗孵育，使用荧光素反应染色。
5. 拍照分析：用 Nuance® 多光谱成像系统（PerkinElmer 公司）拍摄，也可使用其他多光谱成像系统如 Vectra®， Mantra® 等，并用配套 inForm® Tissue Finder™ 模式识别软件进行成像分析。
流程优化
1. 抗体稀释优化
多重染色之前，先摸索单通道下每一个单抗的最佳浓度范围。以 PD-L1 抗体为例，通过梯度稀释抗体，测试阴性（PC-3）和阳性（Karpas-299）样本的荧光强度，计算信噪比（S/N）和最高荧光强度（以每细胞平均荧光强度表示）同时能满足的稀释比例/范围。
图中 1：1400 是荧光强度较强的情况下，信噪比可接受的最佳点。在更高的信噪比测试点中，平均荧光强度降低较明显，使得其他测试点变为次佳选择。
强烈建议在多重染色之前先进行这种单通道测试以达到最佳效果。
2. 抗体-荧光素匹配
多重染色需要平衡待检样品中靶点峰度和各通道信号强度。通过此步矩阵式优化尽量做到：寡靶配强光，众靶配弱光。
下图中 PD-L1 搭配 Cy3® 的荧光信号最强，但信噪比低。FITC 信噪比高，但荧光强度弱。 Cy5® 综合来看能达到二者的平衡，因此最适合搭配 PD-L1。
3. 染色顺序优化
TSA 原理的多重荧光免疫组化中，由于染料是依次共价偶联在切片上的，并需要通过加热洗去前续抗体，因此需要确定染色顺序，以保证：A. 多次加热切片不会影响后续靶点表位完整性；B. 前续偶联的荧光素能耐受后续加热过程。
基于以上荧光素染色要点，我们可以将原来确定染色顺序的排列问题 =120 种情况，简化成 5 x 5=25 优化测试方案。针对每一个抗体-荧光素匹配通道，根据以下表格来进行摸索：
例如，分别针对每一个抗体进行如下测试：第一位染色顺序的测试中，切片 PD-L1 抗体孵育，Cy5® 染色前已经进行了抗原修复加热一次；在孵育之后，再微波加热处理 5 次。第五位染色顺序的测试中，切片 PD-L1 抗体孵育之前，微波加热 5 次，孵育之后，然后再微波加热一次。这样的测试矩阵能够测定抗体、荧光素的结合能力和稳定性。
从下图结果可以看出：染色顺序越早 Cy5® 荧光信号越弱，信噪比是在第 1 和第 5 位最低。信噪比最高的是将 PD-L1 安排在第 2 和第 4 位。如果同时考虑其他的抗体-荧光素配对，则将 PD-L1 和 Cy5® 安排在第 2 位最佳。
4. 构建多光谱库
在多色模式下，每一靶点自身产生的荧光素信号和同一组合中其他相关荧光素产生的信号同时被收集构建一个光谱库， 进行线性分离分析。
简单来讲，需要让分析软件认识多色模式中每一个荧光素的发射光谱，从而将针对特定靶点的真实信号同其他荧光素产生的信号区分开。并将每一个荧光素信号附以伪彩，黑色伪彩被定义为样本自发荧光，则可以在最后图像采集和处理时将信号减掉。
5. 单通道和多通道信号对比
为了进一步优化和理解多通道染色对真实信号的影响，可以进行多色和单色染色的对比。为避免处理的差异，所有的切片都进行了同样的加热和冷却处理。
从图中可以看出 5 色中的 4 色有不同程度的平均荧光强度降低，可能的主要原因是「抗原遮蔽」，即前续 TSA 反应干扰了后续的抗原抗体结合。
6. 显色法和荧光法对比
进一步比较不同原理的染色方法，确定验证不同靶标表达范式和表达量的真实性。图中非连续切片，视野不同。请留意箭头处的表达位置。
7. 多通道染色（5 个靶点+核复染）
此组合能够展现出肿瘤上皮细胞（CK）、肿瘤微环境和肿瘤浸润淋巴细胞的空间关系，可以为 PD-L1 疗法和肿瘤免疫评分提供重要参考。
结论
TSA 技术下多重荧光免疫组化相比传统的多重荧光而言，具有：信号放大倍数高、简化抗体选择、易于设计优化、超多通道同时检测 、全景展示蛋白表达特征、节约样品等诸多优点。而且 CST 所有 IHC-P 验证过的抗体都可以用在这类应用中，随着技术的推广，更多应用手册的更新，必将得到更广泛的应用。
不难看出，正在做肿瘤免疫 mIHC 的小伙伴有福了，再也不用自己苦苦测试实验条件选择抗体了。上面的实验条件直接拿去用吧。 CST 已经推出了适用于 mIHC 小包装抗体试剂盒，大家可以直接购买尝试：
其他领域的小伙伴也不要担心，CST 的科学家正在加紧测试各种实验条件，相信不久的将来，更多的实验方案会推出供大家选择使用。
mIHC Panel 列表及 mIHC 成套素材
怎么样，有没有飞一般的感觉？
文章来源：CST
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