在发酵工业中,对培养基和发酵设备的灭菌广泛使用湿热灭菌法。工厂里,蒸汽比较容易获得,控制操作条件方便,是一种简单而又价廉、有效的灭菌方法。
用湿热灭菌的方法处理培养基,其加热受热时间与灭菌程度和营养成分的破坏都有关系。营养成分的减少将影响菌种的培养和产物的生成,所以灭菌程度和营养成分的破坏成为灭菌工作中的主要矛盾,恰当掌握加热受热时间是灭菌工作的关键。
一、湿热灭菌相关理论:
1、微生物的死亡速率:对数残留定律
微生物受热死亡的原因,主要是因高温使微生物体内的一些重要蛋白质,如酶等发生凝固、变性,从而导致微生物无法生存而死亡。微生物受热而丧失活力,但其物理性质不变。在一定温度下,微生物的受热死亡遵照分子反应速度理论。在灭菌过程中,微生物的死亡速率与任一瞬时残存的活菌数成正比,即对数残留定律。
用N表示残留活菌个数,则活菌的减少率(死亡率)与N呈线性关系,即:
积分边界条件:N0→Nθ;t0=0
注:
式中,θ:灭菌时间(s);
K,灭菌速度常数;
N0:灭菌开始时培养基中杂菌个数(个);
N:经过灭菌时间θ后残存的活菌数(个),一般取N = 0.001,即1000次灭菌中有1 次失败
关于上述公式几点说明:
(1)K值越大,微生物越易死亡;
(2)一定温度下,K随M种类不同而异。一般来说,细菌营养体、酵母菌、放线菌、病毒及噬菌体对热的抵抗力较弱,而细菌芽孢、霉菌孢子则较强。
(3)随着温度的变化,K有很大变化。温度对K的影响遵循阿仑尼乌斯定律:
A:系数,s-1;
△E:活化能,J/mol;
R:气体常数,8.314 J/(mol·K);
T:绝对温度。
2、两种常见灭菌方式:分批灭菌和连续灭菌理论时间计算及优劣比较
(1)分批灭菌
分批灭菌通常分为升温、保压和降温三个阶段。
如只考虑保温阶段,以耐热的芽孢杆菌为灭菌对象,发酵罐内装培养基40m3,121℃分批灭菌,初始培养基中含芽孢107个/mL,关于理论灭菌时间T计算可根据公式:
其中A=1.34×1036 s-1,
ΔE=2.844×105 J/mol,
则k=0.0281 s-1;
No=40×106×107=4×1014个,
Nt=0.001个,则T=24min,
理论上与一般分批灭菌条件121℃灭菌30min相差不大;若考虑升温阶段对灭菌的贡献,初始温度从100℃计算,从保温开始时培养基中活微生物数不是No而是Np,则:
其中Km为100℃至121℃时间内灭菌常数平均值:
km=0.0061s-1,Np=2.65×1011个,保温灭菌时间T=19.7min。考虑升温段的灭菌作用后,保温时间比不考虑的减少了18%。因此,发酵罐体积越大,其分批灭菌的升温时间长,就更应考虑升温段的灭菌作用,其保温时间应更短。
(2)连续灭菌
连续灭菌过程中,培养基需要在短时间被加热到灭菌温度(130-140℃),短时间保温(5-8min),快速冷却,进入已灭菌完毕的发酵罐。如忽略升温的灭菌作用,根据公式
得到停留时间T=2.7min。从上述数据得出连续灭菌时间短,培养基中营养物质损耗相对较少,然而连续灭菌对设备要求较高。
二、影响培养基灭菌效果的主要因素
1、培养基成分
培养基中的油脂、糖类和蛋白质通常能够增加微生物的耐热性,使微生物的热致死速率变慢,这主要是因为有机物质会在微生物细胞外形成一层薄膜,阻碍热的传入,因此应提高灭菌温度或延长灭菌时间。相反培养基中高浓度的盐类(如8%以上NaCl溶液)、色素会减弱微生物细胞的耐热性,一般较易灭菌。在固形物含量高的情况下,灭菌温度要高些。
2、培养基的pH值
pH对微生物的耐热性影响很大。在pH6.0-8.0范围内微生物最耐热,pH<>时,氢离子极易渗入细胞内,从而改变细胞的生理反应促进其死亡,故pH愈低,灭菌所需的时间愈短。一般微生物生长对培养基的pH都有一定的要求,在不允许调节pH的情况下,就要考虑适当延长灭菌时间或提高灭菌温度。
3、培养基的物理状态
培养基的物理状态对灭菌有极大的影响。固体培养基的灭菌时间要比液体培养基的灭菌时间长,如果100℃时液体培养基的灭菌时间为1h,固体培养基则需要2-3h才能达到同样的灭菌效果。其原因在于液体培养基灭菌时,热量传递是由传导作用和对流作用完成的,而固体培养基只有传导作用而没有对流作用。此外,液体培养基中水的传热系数要比固体有机物质大得多。越浓稠的培养基灭菌所需时间越长。
4、泡沫
泡沫中的空气会形成隔热层,使传热困难,对灭菌极为不利。对易产生泡沫的培养基进行灭菌时,可加入少量消泡剂。
5、培养基中的微生物性质与数量
不同成分的培养基中含菌性质与量是不同的。培养基中微生物数量越多,达到无菌要求所需的灭菌时间也越长。天然基质培养基,特别是营养丰富或变质的原料中的含菌量远比化工原料的含菌量多,因此灭菌时间要适当延长。含芽孢杆菌和霉菌孢子多的培养基,要适当提高灭菌温度或延长灭菌时间。
6、冷空气排除情况
高压蒸汽灭菌的关键问题是为热的传导提供良好条件,而其中最重要的是使冷空气从灭菌器中顺利排出。因为冷空气导热性差,阻碍蒸汽接触欲灭菌物品。降低蒸汽分压使之不能达到应有的温度,如果灭菌器内冷空气排除不彻底,压力表所显示的压力就不单是罐内蒸汽的压力,还有空气的分压,罐内的实际温度低于压力表所对应的温度,造成灭菌温度不够,检验灭菌器内空气排除度,可采用多种方法,最好的办法是发酵罐同时装有压力表和温度计。
三、全自动发酵灭菌技术
自动灭菌介绍:
灭菌在发酵过程中是一道必不可少的工序,决定着后续细菌培养的成败,当然,灭菌过程也会对培养基有一定的损伤和破坏作用。一段高质量的灭菌过程,既能够确保灭菌效果(除菌率99.999999%),又能够确保培养基的新鲜度。目前国内传统发酵设备采用人工操作,三路进汽的方式对发酵罐进行实罐灭菌,人为影响不确定因素较大。甚至于出现同样的培养基配方,同样的发酵工艺,发酵收率相差很大。国外目前大都采用智能控制,自动灭菌的方案。能够确保灭菌过程中的培养基的受热和损伤程度一致,设备多冷点监测,可以确保灭菌过程无死角。还可以降低了人工劳动力,减少了人为不确定因素导致灭菌失败的风险。
自动灭菌控制界面由丰泽生物提供
自动灭菌特点:
全自动原位在线灭菌整个过程采用PLC全自动线性控制,其特点如下:
1 温度控制:罐内温度控制精度及灵敏度高,多阶段温度控制可保证升温、恒温及降温分段控制及强大的延时功能,
2 压力控制:高保真的压力模拟曲线控制确保了罐头杀菌过程的补压、反压及特殊产品杀菌的压力控制。
3 操作流畅:发酵控制系统中可存储多个杀菌公式,亦可现场方便地输入新的杀菌公式,适合于不同产品的灭菌。温度实时在线控制及显示可使操作工及时掌握整个杀菌过程,完美的人机对话功能可使操作人员简易的完成操作。
4 完美记录:全自动灭菌技术采用了我们成熟的杀菌温度记录系统技术,控制系统通过RS485通讯和电脑连接,系统可实时地显示整个杀菌控制过程,亦可将杀菌过程的温度压力曲线自动地存储到计算机中,用户可以随时查阅。也可以通过打印机随时打印,可实现工厂远程控制和远程数据管理。
文/风卷残云 整理
本作者主要出没于《发酵工程》代谢机理研究群、《发酵工程》大工艺6群
江苏丰泽生物工程设备制造有限公司
创建于2001年5月,注册资金11600万元,占地面积21320平方米。公司专业从事全自动发酵设备的设计、制造以及自动化生物反应过程控制软件的研究、开发,产品广泛应用于现代生物工程各领域。已有3000台套的各类发酵设备在全国的制药、食品、饲料、肥料、环保、高校、科研院所等行业运行。
目前市场占有率达 50% 以上。
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