某小组应用基因工程方法开展适用于该生态工程的抗虫植物改良研究。为提高将重组DNA分子导入受体细胞的效率，除考虑导入方法、筛选条件、防止污染外，还需考虑的主要因素有________（答出2点即可）。农杆菌介导法是目前植物转基因的常用方法，该方法的基本过程是农杆菌感染植物时________并将其插入到受体细胞的基因组中。欲获得稳定遗传的抗虫性强的转基因植物品种，则转入的抗虫基因必须能在受体细胞中________。
参考答案：
重组DNA的质量（浓度、数量） 受体细胞的生长状态（密度通透性）
重组DNA（重组质粒、含目的基因的T-DNA）导入受体（植物）细胞
稳定和高效（大量）表达（转录和翻译、合成蛋白质）
让我们回顾几个重要概念：
v农杆菌
是一种革兰氏阴性土壤杆菌,它含有Ti质粒,能诱导被侵染的植物细胞形成肿瘤,即诱发冠瘿瘤.Ti质粒(包括Ri质粒)上有一段转移DNA,在农杆菌侵染宿主植物时,这段DNA可以转移进植物细胞,并稳定地保留在植物细胞染色体中,变为植物细胞新增加的一群基因,最终能通过有性世代遗传给子代 。
vTi质粒
存在于能引起植物形成冠瘿瘤的农杆菌中，诱导双子叶冠瘿瘤形成，又称肿瘤诱导质粒（tumor inducing plasmid）。
vT-DNA
Ti质粒上含有一段DNA可以转移到寄主的染色体内，是整合到植物基因组的农杆菌质粒DNA片段，称为转移DNA（Transferred DNA），简称T-DNA。是一种由三股ssDNA旋转螺旋形成的一种特殊脱氧核糖核苷酸结构。T-DNA自身并不编码任何与转移和整合有关的酶，这一特性使得它可携带外来基因进入植物细胞。T-DNA的转移需要毒性（ vir）区编码蛋白参与，毒性区含有8个主要的基因座，即virA 、virB、virC、virD、virE、virF、virG 和virH 等，每个基因座又分别含有1至多个基因，这些基因编码的蛋白是介导T-DNA转移的主要成份。
v转化机制
与植物基因转化有关的农杆菌有两种类型：根癌农杆菌（Agrobacteriumtumefaciens）和发根农杆菌（Agrobacterium rhizogenes）。根癌农杆菌含有Ti 质粒。发根农杆菌含有Ri 质粒。根癌农杆菌的Ti 质粒和发根农杆菌Ri 质粒都具有一段转移DNA (transfer DNA，又称T-DNA)，在农杆菌侵染植物时，T-DNA 可以插入到植物基因组中，使其携带的基因在植物中得以表达。由于T-DNA 能够进行高频率的转移，而且Ti 质粒和Ri 质粒上可插入大到甚至150kb的外源基因，因此，Ti 质粒和Ri 质粒成为植物基因转化中的理想载体系统。
原始的Ti质粒根据其功能的不同，可分为4个区：
（1）T-DNA区：是在农杆菌侵染细胞时，从Ti质粒上切割下来转移到植物基因组中的一段DNA，其携带的基因与肿瘤的形成有关，但与T-DNA本身的转移与整合无关。T-DNA上最重要的是两端的2个边界(LB和RB)，它们是T-DNA转移所必需的。只要其存在，T-DNA可以将携带的任何基因转移并整合到植物基因组中， T-DNA的右边界在T-DNA的整合中对于靶DNA位点的识别具有重要作用 ，因此，尤以右边界更为重要。
（2）毒性区：位于T-DNA以外的1个30~40 kb的区域内，该区段编码的基因但对T-DNA的转移和整合非常重要．这些基因也称为Ti质粒编码毒性基因(vir)。
（3）接合转移区： 该区段存在有与细菌间接合转移有关的基因(tra)，调控Ti质粒在农杆菌间转移。
（4）复制起始区：该区段调控Ti质粒的自我复制。在遗传转化过程中除了Ti质粒上的基因参与外，还有农杆菌染色体基因。染色体基因包chvA、chvB、att、pscA、chvD以及chvB。它们大多编码一些膜相关蛋白，负责细菌向植物受伤细胞趋化移动和帮助细菌附着于植物受伤细胞上。延伸因子P对于农杆菌的生长非常重要，但非必需 ．高水平的糖结合蛋白一ChvE可以扩大VirA蛋白对酚类物质的识别范围 。结合ATP盒式转运体类似物蛋白ChvD， 参与Vir区基因的表达调控，chvD基因座中插入无启动子的lacZ，农杆菌侵染力以及Vir区基因表达量大大下降，ChvD突变体中virG组成型表达侵染力则得以恢复，这一现象说明ChvD通过影响virG表达控制毒性。
Vir 基因的诱导表达机制
在植物受到创伤后，创伤组织的细胞释放出创伤信号——酚类化合物，如乙酰丁香酮。当农杆菌接受到此类信号时，其vir 区基因可被诱导转录。另一类诱导化合物是组成植物细胞壁的一些特异单糖，As 和单糖可协同诱导Ti 质粒上vir 区基因的表达。Vir区基因的活化首先是从virA 基因开始的。VirA 蛋白是一种结合在膜上的化学受体蛋白，可直接对植物产生的酚类化合物感应，其感应部位可能位于胞质区域。VirA 蛋白的胞质区域有自激酶的功能，自身被磷酸化激活后，使VirG 蛋白活化。VirG 蛋白是DNA 结合活化蛋白，可以以二体或多体形式结合到vir 启动子的特定区域，从而成为其它vir 基因转录的激活因子，打开VirB、virC、virD、virE、virH 等几个基因。ChvE可大大增强vir 基因被As 诱导的效果，ChvE 可结合一些单糖，也可直接与VirA 周质区相互作用，以加强As 对Vir 基因的诱导。
T-DNA 复合物的形成
T-DNA 的加工与转移是由Vir 基因被诱导后产生的蛋白完成。VirD基因编码的两个产物VirD1和VirD2直接参与加工过程。VirD1 蛋白是一种拓扑异构酶，可将超螺旋型DNA 变成松弛型DNA。VirD2 蛋白具有特异剪切单链DNA的内切酶活性，它可以识别T-DNA 底链边界重复序列上的特定位点，并在底链24 bp 重复序列和第四个碱基之间切割，将T-DNA 从Ti 质粒上剪切下来，称为T-strand 或T-链。切开T-DNA后，VirD2 蛋白与T-链的5，端共价结合，避免核酸外切酶降解T-链。新的T-DNA 底链以此链为模板，从右端产生的DNA 缺口处以5’-3’方向进行合成。被取代的旧链游离出来，与许多VirE2蛋白分子结合组成T-DNA 复合体。此外，VirD2 作为一个导向蛋白，可以指导整个T-DNA 复合体（或叫T-复合体）从农杆菌进入到植物细胞核。
T-DNA 复合物的跨膜转运
农杆菌的T-DNA 转移通道由多达12 种蛋白组成，包括两个主要部分：纤毛附属丝（或纤毛）和膜结合复合体。该通道也可称为T-复合体运输器，由virB 编码的11 种蛋白和VirD4蛋白组成。VirB1可在细菌膜上为T-复合体运输器的装备提供位点；VirB2 和VirB5 可被移动到细胞表面形成纤毛；其余的VirB、VirD4 为T-复合体的运输提供能量。合成的T-复合体经过T-复合体运输器，以类似于细菌转导过程的方式注射到植物细胞内，并在VirD2 和VirE2 的核定位信号（NLS）序列引导下，以VirD2为先导向植物细胞核运动。在人工构建的质粒中，vir 基因和T-DNA 可以放在同一个质粒上，也可以放在不同的质粒上。
影响转化效率的因素
1、菌株染色体背景
不同农杆菌株的类型的chv基因决定了其对受体细胞的识别和附着能力的差异。根癌农杆菌的胭脂碱型和琥珀碱型生长快、不结球，转化易于操作，但共培养时菌体附着能力较差：章鱼碱型则生长慢、易结球，转化难于操作，但共培养时菌体附着后不易洗去。
2、 共培养方式
农杆菌转化的共培养介质可以是细菌培养基或植物受体培养基。烟草等对农杆菌侵染比较敏感的植物的共培养时间一般较短，液体细菌培养基介质应用较多。许多单子叶植物等不敏感植物受体与农杆菌共培养时间一般较长，用细菌培养介质容易造成农杆菌过度繁殖，导致植物外植体呼吸作用抑制和细菌分泌物毒害，因此多采用液体植物培养基作为共培养介质。
3、侵染浓度和时间
农杆菌适宜的侵染浓度和时间因外植体对侵染的敏感性不同而有很大差异。浓度过高、时间过长会引起农杆菌细胞间的竞争性抑制，而且过度增殖会抑制受体细胞的呼吸作用；浓度过底、时间过短则造成受体细胞表面农杆菌附着不足。禾谷类作物一般侵染浓度较高，Hiei用LBA4404(pTOK233)转化水稻的最佳接种浓度为OD600=0.8~1.0， Ishida用LBA4404(pSB131)转化玉米幼胚采用的侵染浓度为OD600=2.0；但烟草、大白菜等对侵染敏感的双子叶植物要求菌体浓度要低的多,一般为OD600= 0.5。
4、共培养条件
（1）共培养温度 农杆菌在20~30℃的范围内都可以生长，不同研究结果中vir区基因表达的适宜温度有一定差异，但多数在20~25℃获得较高的表达水平[]。外植体生长温度也一般在此范围内，所以通常选取外植体的最佳生长温度为共培养温度，通常在25℃左右。
（2）共培养PH值 研究人员普遍认为酸性培养环境有利于农杆菌的侵染。因为植物细胞释放的对农杆菌有趋化作用的化学物质（如酚类、糖类）虽然在不同酸碱度下比较稳定，但在pH=5.0~5.8时对vir基因的诱导能力最高。
（3） 诱导物和抑制物 酚类是vir区基因表达的主要信号物质。酚类物质产量低一度被认为是影响农杆菌转化，特别是单子叶植物转化的主要原因之一。在众多的酚类物质中，乙酰丁香酮和羟基乙酰丁香酮诱导能力较强，AS的促进效果与菌株类型、植物材料种类和共培养培养基的pH值有关。没食子酸、二羟基苯甲酸、香草酚、儿茶酚、对羟基苯酚等多酚混合处理农杆菌也有很高的作用，但不同酚类物质是否有累加效应在不同研究结果中不近相同。不同农杆菌类型对酚类物质的敏感性不同，根癌农杆菌的章鱼碱株系比胭脂碱系需要更高的酚类物质诱导，发根农杆菌的农杆碱型比甘露碱型对酚类物质刺激的敏感性更低。糖类等小分子,这些小分子一方面可作为化学源吸引农杆菌的趋化运动,另一方面可诱导或抑制农杆菌vir基因的表达。而糖类的主要作用是与农杆菌染色体毒性蛋白ChvE结合,激活virA蛋白进而诱导vir基因高水平表达和扩大农杆菌的寄主范围。特别在AS浓度很低的情况下,它们可强烈诱导vir基因的表达,并且与AS存在协同效应,可显著提高AS诱导效果。糖类在不含酚类化合物的情况下效果较明显,但是糖类和酚类化合物同时存在时却没有明显的协同效应。多胺也参与植物宿主和病原之间的相互作用。Kumar等曾用多胺物质对农杆菌进行活化后侵染烟草做GUS瞬时表达研究,结果表明农杆菌的侵染活力显著提高。
（4）共培养时激素的添加、有无光照，共培养培养基中添加生长素、细胞分裂素对转化更有利。而光照的有无要是植物种类而异。
5、受体类型和生理状态
不同基因型对农杆菌侵染敏感性有差异。目前用过的受体材料有叶盘、叶柄、根尖根段、茎尖茎段、幼穗、花药、子叶（柄）、胚或其部分结构（胚轴）、芽等，可以看出分生组织是较通用的受体。分生能力强的植物细胞对农杆菌敏感，活跃的细胞分裂促进了 T-DNA的整合。
6、预培养培养基
外植体进行共培养前,在含有外源激素的培养基上预培养一段时间,使植物组织代谢活跃,促进细胞分裂,分裂状态的细胞更易整合外源DNA,从而提高外源基因的瞬时表达和转化率。有人认为,在预培养时降低钙的含量会促进农杆菌的侵染。钙在对致病微生物抵抗方面起到重要作用,而钙的不足会引起细胞壁结构的改变,这种改变使农杆菌更容易附在愈伤上,增强农杆菌对愈伤的感染能力。
7、接种方式
比较常用的接种方式是将外植体置于侵染液中浸泡,时间长短视菌种和外植体种类而异。有的研究者在浸泡的基础上结合了振荡进行接种，振荡培养能打破细胞表面的气泡,使农杆菌与外植体的接触面增大,有利于农杆菌侵染。近年来,在提高遗传转化效率方面发展了一些新技术,如超声波辅助农杆菌介导法、负压与农杆菌介导结合法以及基因枪与农杆菌介导结合法等,均可增强农杆菌浸染,提高转化效率。
8、 感受态细胞保存条件
有实验表明，农杆菌感受态细胞以新鲜制备时效果较好，农杆菌感受态细胞在4℃保存7 d以内时进行转化可以得到部分转化子，而用甘油保存置于-20℃和-58℃的感受态细胞转化效率较低。不过应该根据自己的试验情况进行优化。
另外，植物基因型、靶细胞生理状态及对转化植株的筛选程序、外植体处理、合适的再生筛选体系等因素也会对转化效率产生影响。
几个转化实例：
A：HiII未成熟胚侵染7d后的GUS瞬时表达情况
B：诱导培养基上生长两周的愈伤组织
C：四周后诱导出II型胚型愈伤组织
D：愈伤诱导阶段后期GUS稳定表达情况，整个愈伤块被染成了蓝色
E：再生两周后筛选出健康的抗性绿芽
F：转化4个月后获得抗性植株，可直接取样检测或移栽进入温室。
转化效率：~30%（以HiII未成熟胚为例）；~10%（以选定自交系品种未成熟胚为例）
转化效率=（PCR阳性植株数/侵染的外植体数）×100%
转化效率：～10%（以William82子叶节转化为例）
转化效率=（PCR阳性植株数/侵染的外植体数）×100%
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