靶向共价抑制剂的研究

靶向共价抑制（Targeted covalent inhibition，TCI）疾病相关蛋白是药物发现领域的一种强有力工具。靶向非保守氨基酸残基的共价修饰则可能实现小分子对不同氨基酸突变的同种蛋白的选择性，这在癌症药物研发中尤为重要。共价抑制剂与氨基酸残基的反应活性需要控制在一个适当水平，反应活性过高将直接导致毒性。目前，应用较为广泛的是一些弱反应活性的共价抑制基团，比如缺电子烯烃。缺电子烯烃可以对半胱氨酸残基进行可逆的共价修饰。

日前，阿斯利康（AstraZeneca）的Neil P Grimster和Qibin Su等人在Nature Chemical Biology上报道了一种羰基苯硼酸类可逆共价抑制剂。该抑制剂可以靶向蛋白Mcl-1（Myeloid cell leukemia 1）的非催化赖氨酸残基Lys234，该类可逆共价抑制剂的发现为基于Mcl-1的药物开发提供了新的方向。要知道，Mcl-1与多种癌症的发生发展相关，例如白血病、多发性骨髓瘤等，而且这个蛋白目前很难通过已有的药物化学策略来进行抑制。（Inhibition of Mcl-1 through covalent modification of a noncatalytic lysine side chain. Nat. Chem. Biol., 2016, DOI: 10.1038/nchembio.2174）

图片来源：Nat. Chem. Biol.

咱们就来看一下他们是如何层层深入完成这项研究的。作者首先分别用2-甲酰基苯硼酸（1）和2-乙酰基苯硼酸（2）与赖氨酸衍生物（3）在重水中混合，用1H-NMR监测共价键生成和断开的过程。

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为了设计Mcl-1的可逆共价抑制剂，作者分析了Mcl-1的晶体结构认为Lys234有很大可能被共价修饰。随后，作者利用分子对接技术对基于化合物4设计的共价抑制剂进行了虚拟筛选并最终合成了化合物5和6以及它们相应的对照分子7-12。

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作者对合成的化合物5-12进行了蛋白水平活性评价以及细胞水平活性评价。结果表明，羰基和硼酸同时存在于苯环邻位的化合物呈现出高活性水平。

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作者又选择细胞凋亡作为主要指标分别评价化合物对Mcl-1依赖型细胞和非依赖型细胞的作用。结果发现化合物5和11对上述两种不同类型的细胞诱导凋亡的作用完全不同。作者进而将化合物11加入到Bak沉默的NCI-H23细胞中，其活性显著下降。随后，作者通过免疫共沉淀手段证明了化合物11直接作用于Mcl-1-Bak蛋白复合物。至此，作者从蛋白水平和细胞水平上证明了化合物5、6、11对Mcl-1的靶向性。

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靶向性证明完了，接下来就要验证这类抑制剂的可逆性共价结合特点。

要说检测共价修饰蛋白的利器莫过于质谱。这么重要的手段，作者自然不会放过。为了避免硼烷亚胺在质谱条件下断键，作者使用了氰基硼氢化钠处理Mcl-1与化合物5（其实就是个还原胺化反应嘛~）。质谱分析结果证明了化合物5与Mcl-1的共价结合。另外，作者还借助质谱手段比较了化合物5和6对Mcl-1共价修饰的速度，化合物5的反应速度更快一些。

在证明完化合物5和6对Mcl-1的共价修饰行为之后，作者利用表面等离子共振（SPR）技术对其可逆性结合特点进行了研究。实验结果证明化合物5和6与Mcl-1结合的可逆性。作者又评价了化合物5、6、8、12对Mcl-1抑制作用的时间依赖性，进一步验证了化合物5和6的可逆性结合。

那共价修饰位点到底是不是Lys234呢？

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这个最精细的问题自然要放到最后解开谜底。验证方法也是生物化学的经典方法啦，把Mcl-1的Lys234突变成Ala234，即得到Mcl-1的K234A突变体。作者分别测定了化合物6和8对Mcl-1K234A的IC50，结果表明化合物6的活性显著降低。作者进一步利用质谱手段检测Mcl-1K234A与化合物5或6的复合物，没有检测到任何的共价修饰。这就和作者开始猜测的共价修饰位点完全吻合。

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全文读完，这篇文章给人的感觉是简洁明快，丝丝入扣。先阐明如何设计出羰基苯硼酸类Mcl-1共价抑制剂，再证明抑制剂的共价结合特性和可逆结合特性，最后阐明共价修饰位点。每个环节应用的技术手段都是该领域内广泛应用的经典技术，但是组合应用起来却创造出如此新颖的工作。请允许我最后感叹一下，这真是一篇低调、奢华、有内涵的文章。