抽象的
弹性蛋白酶是一种蛋白水解酶，属于由人类嗜中性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞和内皮细胞产生的水解酶家族。已知人中性粒细胞弹性蛋白酶在人体中发挥多种作用，但其活性增加可能会导致多种疾病。弹性蛋白酶抑制剂可以预防银屑病、慢性肾病、呼吸系统疾病（包括 COVID-19）、免疫疾病甚至癌症的发展。在多酚类化合物中，一些黄酮类化合物及其衍生物（主要存在于草本植物中）已被证实会影响弹性蛋白酶的释放及其对人体细胞的作用。这篇综述着重于从天然来源中发现并在生物化学上被表征为类黄酮的弹性蛋白酶抑制剂。对弹性蛋白酶的抑制活性是黄酮苷元及其糖苷和甲基化、乙酰化和羟基化衍生物的特征。所提出的结构-活性关系 (SAR) 分析能够确定对弹性蛋白酶产生抑制作用的化学基团。进一步研究，尤其是所描述的天然化合物的体内功效和安全性是有意义的，以便更好地了解它们促进健康的潜力。
介绍
抑制人类酶活性是治疗全球疾病的一种有趣策略，并且可能是追求新药发现的有吸引力的目标1。通过弹性蛋白酶抑制剂调节酶活性是治疗类风湿性关节炎、肾小球肾炎、肺气肿、肺部疾病、银屑病和癌症2、3的有希望的努力。
中性粒细胞对先天免疫反应至关重要；因此，他们参与抗击感染。中性粒细胞活化和脱粒导致丝氨酸蛋白酶（弹性蛋白酶、蛋白酶 3、组织蛋白酶 G）作为蛋白水解活性酶释放到细胞外空间，能够降解广谱的细胞外基质 (ECM) 蛋白，例如纤连蛋白、弹性蛋白、或胶原蛋白，为组织提供物理支持和稳定性4-7。中性粒细胞衍生的蛋白酶，包括弹性蛋白酶，具有通过产生免疫反应来控制炎性细胞因子作用的能力。然而，人类中性粒细胞弹性蛋白酶 (HNE) 也能够加剧其他疾病的出现8-10.HNE 属于丝氨酸蛋白酶的糜蛋白酶超家族，参与细胞内和细胞外病原体破坏的非氧化途径。弹性蛋白酶由人类中性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞和内皮细胞产生，主要储存在嗜天青颗粒和核膜11、12中。在生理条件下，HNE 会被天然丝氨酸蛋白酶抑制剂（包括 elafin、α1-抗胰蛋白酶和分泌性白细胞蛋白酶抑制剂 (SLIP)5 ）抵消.然而，内源性抑制剂的保护作用可以通过中性粒细胞与其他白细胞产生的 ECM、氧化剂和蛋白酶的粘附以及通过将 HNE 与细胞膜上的受体强烈连接而失活，从而抑制与可接近的内源性抑制剂的结合13。总体而言，HNE 及其抑制剂数量的波动在诱发多种人类疾病中起关键作用。
尽管可以使用合成抑制剂，但天然衍生药物的鉴定对于鉴定没有令人不快的副作用的抑制剂来说是一个有价值的研究领域。在多酚类化合物中，一些主要存在于草本植物中的黄酮类化合物及其衍生物是弹性蛋白酶的潜在抑制剂，几乎没有副作用。本综述侧重于黄酮类化合物及其衍生物在弹性蛋白酶抑制剂开发中的多种作用和功效。
方法论/搜索策略
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人中性粒细胞弹性蛋白酶的生物学功能
在成年哺乳动物中，中性粒细胞在骨髓中产生，并在某些生理条件下释放到血液和组织中。人体每天每公斤体重产生超过 10 亿个中性粒细胞。然而，在各种自身免疫和炎症性疾病期间，它们的数量可以扩大到 100 亿。在炎症环境中，中性粒细胞可以存活 7 天，这可能与细胞因子激活的内皮细胞作用有关14.它们是抵御细菌和真菌感染的第一道防线，有助于对抗寄生虫和病毒。它们的多种功能包括防止活性氧 (ROS) 和水解酶以及消除病原体，从而使它们成为整体免疫和炎症反应（吞噬作用、脱粒和 NETosis）的重要组成部分。另一方面，这种类型的白细胞能够在各种自身免疫性疾病和炎症性疾病中造成组织损伤，并在各种病理15中发挥重要作用。
中性粒细胞的功能之一是产生和释放丝氨酸蛋白酶（弹性蛋白酶、蛋白酶 3 和组织蛋白酶 G）。众所周知，HNE 在人体中发挥多种作用。弹性蛋白酶是一种具有细胞毒性的 29 kDa 蛋白酶，序列分析表明它由具有单链和 218 个氨基酸的多肽组成，其中四个分子内二硫键连接八个半胱氨酸残基16、17。
释放酶以通过其控制细胞凋亡的能力来防御入侵的病原体18,19。中性粒细胞弹性蛋白酶 (NE) 的作用机制是基于裂解细菌毒力因子及其外膜蛋白并与细菌膜10结合。此外，HNE 通过 Toll 样受体 4 (TLR4) 激活和其他促炎细胞因子的释放诱导白细胞介素 8 (IL-8) 参与炎症反应20-22。这种酶还可能导致弹性纤维的降解并诱导角质形成细胞23、24的增殖。HNE的其他生物学功能见表1。
HNE 在感染中的作用
先天免疫反应的主要目标是定位和消灭进入人体的病原体。到达感染部位的第一个免疫系统成分之一是中性粒细胞。它们在 ROS 和参与氧化和非氧化防御途径的酶的帮助下，通过非特异性免疫机制对抗病原体。HNE是具有抗菌活性的先天免疫系统中的关键因素之一。中性粒细胞弹性蛋白酶可以被组织蛋白酶 C 激活，然后该酶参与许多非氧化性免疫反应34。
吞噬作用是针对病原体的防御机制。它是通过细胞膜受体结合和识别病原体而引发的细胞内过程，这些受体随后被吸收到称为吞噬体的结构中35。之后，颗粒附着在被吸收的吞噬体上并脱落其内容物，由此产生的吞噬溶酶体开始降解被吸收的病原体。NE 通过降解外膜蛋白 A (OmpA) 杀死微生物，例如大肠杆菌，这会破坏细胞膜的完整性并导致随后的死亡36。此外，丝氨酸蛋白酶的同时作用导致革兰氏阳性肺炎链球菌在体内吞噬过程中死亡37.
另一种对抗需要弹性蛋白酶的微生物的方法是通过脱粒。与吞噬作用不同，该过程在 ECM 中显示出活性。细胞因子对嗜中性粒细胞的刺激导致颗粒转移到细胞外围，其中颗粒与细胞膜融合，它们的内容物被倒出细胞11。初级颗粒含量针对病原体杀灭过程。然而，由于它们的高毒性，它们被释放，同时对周围组织38、39造成损害的可能性很高。细胞外 HNE 对许多细菌蛋白（例如白细胞毒素）显示出切割作用，这是导致白细胞裂解的一个因素40、41。
此外，HNE 展示了其在 NETosis 中的活性，NETosis 是中性粒细胞用来对付病原体的一种机制。NETosis 是去浓缩和未折叠 DNA 与组蛋白和细胞质颗粒蛋白42的复合物。IL-8 和脂多糖 (LPS) 的诱导导致含有蛋白水解酶的中性粒细胞活化。因此，在这个过程中，NET 参与对抗感染，因为 NE 是影响 DNA 从浓缩形式释放的因素之一。弹性蛋白酶被转运到细胞核，其酶活性是组蛋白降解的决定因素，从而促进 DNA 的释放43。此外，NETs 中的弹性蛋白酶对酵母菌、菌丝形式的真菌（例如白色念珠菌）是一种破坏性因素和细菌，例如福氏志贺氏菌42、44（图1）。
图 1.中性粒细胞的作用机制。(A) 脱粒；(B) 吞噬作用；(C) NETosis。
中性粒细胞弹性蛋白酶抑制剂在人类疾病中的作用
HNE 活性的持续增加可能导致与感染和炎症相关的组织破坏。因此，HNE 功能涉及多种严重的慢性疾病，特别是呼吸、泌尿、皮肤、消化、生殖、神经和骨骼疾病（表 2）。
例如，alvelestat (MPH-966) 是一种口服 NE 抑制剂，通过控制异常炎症反应、肠道屏障功能障碍和肠道微生物群失衡，对 5-FU 诱导的结直肠癌患者肠道粘膜炎具有不良影响58。值得一提的是，另一种 HNE 抑制剂 sivelestat (ONO-5046) 可能是一种有效的药物，可用于治疗 COVID-19 17、59患者的急性肺损伤、急性呼吸窘迫综合征或凝血障碍。此外，可以考虑这种选择性 NE 抑制剂在抑制心肌梗塞后过度炎症和细胞凋亡以及防止小鼠模型中左心室重构方面的作用60.ONO-5046 还限制了大鼠和小鼠模型中胶原蛋白诱导的关节炎的发生率61并预防了博来霉素诱导的小鼠肺纤维化62。据报道，在临床试验中使用其他弹性蛋白酶抑制剂后，如 ZD-0892 和 M249314（肽基三氟甲基酮），肺动脉压力和肌化降低63。
此外，弹性蛋白酶能够破坏 ECM 屏障的完整性，从而直接导致癌症扩张7。
黄酮类化合物对弹性蛋白酶活性的抑制作用
酚类化合物占多种植物次生代谢产物的很大比例。因此，黄酮苷元和苷类仍然是植物界中最广泛的多酚类之一。黄酮类化合物由两个苯环和一个杂环吡喃环组成，根据 B 碳环与 C 碳环的连接点及其氧化程度以及它们的化学取代度，可分为亚组64，65.由于 NE 在愈合过程和类风湿性关节炎、肾小球肾炎、肺气肿、肺部疾病、银屑病甚至癌症的发展中的重要作用，一些研究报告了从天然来源中鉴定出弹性蛋白酶抑制剂。产生次生代谢物和植物化学物质的植物具有作为治疗剂的巨大潜力2,3,66。已经研究了许多植物提取物和化合物的弹性蛋白酶抑制活性，以确定抗弹性蛋白酶药物的新来源。研究了多种类黄酮化合物，包括苷元及其O-和C-糖苷的潜在弹性蛋白酶抑制活性（表 3）。
有报道杨梅素、米西汀、槲皮素、异鼠李素、山柰素、山柰酚的3 -O-β-d-葡萄糖苷酸，山柰酚的3-O-β-2″-O-乙酰基-β-d-葡萄糖苷酸、异鼠李素和槲皮素和山柰酚的 3 -O-β-3″-O-乙酰基-β-d-葡糖苷酸在 1 μM 浓度下显着降低中性粒细胞释放弹性蛋白酶101。在另一项化学和生物学研究中， Hedysarum coronarium地上部分的提取物具有高浓度槲皮素和单宁的 L. 显示出剂量依赖性抑制特性102。
灯盏花素是一种从灯盏花灯盏花中提取的类黄酮，可降低接受心脏直视手术的儿童的肺部炎症反应和肺功能相关的 NE 水平。在服用 1 mg/kg 或 0.5 mg/kg 灯盏花素103的患者中观察到了积极作用。还选择了从Scorzonera latifolia的乙酸乙酯提取物中分离的化合物，以进一步研究它们的抑制作用。槲皮素 3 -O-β-apiofuranosyl-(1‴→2″)-β-d-葡萄糖苷和 7-甲基异荭草素分别显示 30.16% 和 28.60% 的抗弹性蛋白酶活性104。从Malus doumeri获得的根皮素变种。formosana已被证明以浓度依赖性方式抑制弹性蛋白酶。在 36.5–366 µM 的浓度下，观察到 51.8–77.3% 的酶抑制105,106。浓度为 100 µM 的黄酮素樱花素可将弹性蛋白酶的释放减少 60%107。在另一项研究中，樱花素被应用于体内小鼠模型，在预防弹性蛋白酶诱导的肺气肿方面没有显示出不良的临床效果108。在 100 µM 时，从粘花旋花中分离出的 7-O-甲基香树脂可使弹性蛋白酶产量降低 50%107.还评估了甘草素的 NE 释放抑制特性，结果显示 10 µM 的化合物降低了酶活性109。5 -O-demethylnobiletin是一种从黄芪中分离出的多甲氧基黄酮，在 10 µM 时可抑制 48% 的弹性蛋白酶释放。值得一提的是，所描述的类黄酮不影响这种酶110的活性。弹性蛋白酶检测结果表明，在 100 µM 浓度下，柚皮素、甘草素、槲皮素、芹菜素和硫黄素分别具有 39%、52%、65%、57% 和 38% 的抑制活性111。从 EtOAc (乙酸乙酯) 子提取物中分离的化合物的弹性蛋白酶抑制活性还评估了Epilobium angustifolium 。金丝桃苷、山柰酚、山柰酚 3 -O-α-l-鼠李糖苷、槲皮素 3 -O-α-l-鼠李糖苷和槲皮素 3 -O-α-l-阿拉伯糖苷在 100 µg/mL 的浓度下显示出 19.87 的抑制潜力%、15.33%、9.76%、8.92% 和 7.08%，分别为112。
从厚叶天竺葵叶中获得的水乙醇提取物的抑制作用，总黄酮含量为 72.71 µg QE/mg DE，从 0.8 µg/mL（15.79% 弹性蛋白酶抑制）开始，在 4 µg/mL（41.44 %)、8 µg/mL (55.45%) 和 16 µg/mL (50.99%)113。女贞子叶水提物的抗弹性蛋白酶活性是根据黄酮苷元和苷（木犀草素苷、槲皮素芸香苷和女贞子黄酮）的含量测定的。浓度范围为 5 µg/mL 至 50 µg/mL 的水提取物抑制 HNE 释放 23.9–34.1%114。值得一提的是，一种刺槐的乙醇提取物叶的总黄酮含量为 206.3 毫克/克，在体外10 毫克/毫升时表现出 99.2% 的抑制115。发酵红参 (FRG) 基于其弹性蛋白酶抑制效力被研究为一种新型护肤抗衰老成分。FRG 由 133.2 µg/mL 类黄酮化合物组成，可能与弹性蛋白酶抑制活性的 IC50值 (117.07 µg/mL)相关116。对痢疾尤金尼叶水醇提取物 (EDE)进行了表征，以确定其槲皮素和其他酚类物质的含量，EDE 在 25–100 µg/mL 时能够以剂量依赖性方式抑制弹性蛋白酶，在一定浓度下观察到 45% 的活性100 µg/mL117。
许多作者已经根据 EC50值确定了抗弹性蛋白酶活性。Meum athamanticum、Centella asiatica和Aegopodium podagraria水-甘油提取物由大量的类黄酮化合物描述，并显示抑制活性的EC50 (%) 值分别为 0.92、0.52 和 1.03118。
通过亚临界水萃取从黑果花的茎、叶和浆果中获得的提取物也显示出抗弹性蛋白酶的潜力。在这个阶段，研究人员确定了总酚和总黄酮含量。叶子的总酚类和类黄酮含量最高，其次是茎和浆果，酚类提取物分别为 131.53 mg CAE/g 提取物、49.96 mg CAE/g 提取物和 13.88 mg CAE/g 提取物，以及 88.64 mg RE/ g 提取物、25.10 mg RE/g 提取物和 10.00 mg RE/g 提取物分别用于黄酮类化合物。此外，黄酮类化合物占野樱莓中所有酚类化合物的 70% 以上。所有A. melanocarpa提取物表达弹性蛋白酶抑制活性，在浆果提取物中观察到的潜力最高（3.549 ± 0.113 mmol CAE/g 提取物）119。根据 LC-MS 分析，铁皮树皮和豆荚提取物是芦丁、槲皮素、山柰酚、芹菜素、异鼠李素和紫杉叶素的来源，样品在 250 µg/mL 和 20 µg/mL 时显示约 36% 的弹性蛋白酶抑制豆荚提取物120% 。三种黄酮类化合物从心叶木耳叶的乙酸乙酯部分中分离出来：槲皮素、杨梅素 3-葡萄糖苷和杨梅素 3-鼠李糖苷。在无细胞和细胞模型中评估水提取物和乙酸乙酯提取物的抗弹性蛋白酶活性。在非细胞系统中，IC50水提取物和乙酸乙酯提取物的值分别达到 4.7 和 2.2 mg/L。在细胞模型中，多形核中性粒细胞受到 PMA（4β-phorbol-12-myristate-13-acetate）、CaI（钙离子载体）和 fMLP（N-甲酰基-甲硫氨酰-亮氨酸-苯丙氨酸）的刺激。受刺激细胞实验中的 IC50值在乙酸乙酯提取物中为 5.9-8.6 mg/L，在水提取物中为 7.3-12.1 mg/L。在乙酸乙酯和水提取物中，活性更高的提取物是乙酸乙酯，这可能与其较高的类黄酮含量有关121。
类黄酮构效关系 (SAR)
类黄酮 SAR 分析能够确定负责在生物体中引起目标生物效应的化学基团。SAR 可用于解释分子结构特征对其活性的影响（图 2），并且对于确定药物作用122-124的潜在机制至关重要（图 3）。
图 2.临床 HNE 抑制剂的化学结构。(A) MPH-966、(B) ONO-5046 和 (C) ZD-0892。
图 3.负责类黄酮活性 (SAR) 的化学基团。
特别注意了游离羟基的数目、O-甲基化、O-糖基化以及A-环中C-6和C-8位的C-糖基化。带有邻苯二酚基团的天然化合物含有两个相邻的酚 OH 基团（3’,4’-二羟基），表现出抑制活性，这些基团之一的甲基化显着降低了抑制活性。缺乏儿茶酚基团的化合物对弹性蛋白酶作用的抑制作用较弱125.在被研究的四种黄酮类化合物中，槲皮素、杨梅素、山奈酚和高良姜素中，主要的抑制效力是槲皮素，其次是杨梅素。值得一提的是，杨梅素分子 B 环 (C5’) 上的额外 OH 基团显着降低了酚类抑制效力。不含儿茶酚基团的山奈酚和高良姜素没有表现出显着的抑制活性。此外，似乎 B 环中的 O-甲基化会导致这种活性的增加。木犀草素 4’-甲基醚 (IC50 4.13 µM) 比木犀草素 (IC506.91–36.01 µM) 具有更高的抑制潜力。此外，似乎B 环中的O-甲基化导致抑制活性增加。木犀草素 4’-甲基醚 (IC504.13 µM) 具有比木犀草素更高的抑制潜力 (IC506.91–36.01 µM)71,74。
通过分别比较芹菜素和木犀草素及其 7- O-葡萄糖苷 cosmosiin 和 cynaroside的抑制水平，可以观察到 A-环 (C7) 和 C-环 (C3) 位置O-糖基化的重要性。基于IC50值，苷元具有更强的活性，而它们的7 -O-糖苷没有显着的抑制作用。值得一提的是，槲皮素和山柰酚的 3 -O-鼠李糖基化也降低了它们的活性。表 3中的值表明 C-7 或 C-3 位的葡萄糖基化或鼠李糖基化可能会产生空间位阻，阻止分子与酶126结合.此外，芹菜素和芹菜素 4’- O-β-d-葡萄糖苷的抗弹性蛋白酶潜力的比较得出的结论是，B 环中羟基的葡萄糖基化也会降低其活性70,77。
A 环的C-糖基化发生在 C6 和 C8 位置，这是类黄酮骨架中糖基自由基最典型的位置。似乎苷元木犀草素和芹菜素比它们的 8-C-葡萄糖苷表现出更强的抑制作用。另一方面，异牡荆素和芹菜素 6-C-葡萄糖苷是比它们的苷元更有效的弹性蛋白酶抑制剂（见表 3）。
抑制作用也可能与黄酮类化合物125、127的C-环中碳C-2和C-3之间的双键有关。建议 C 环中的双键允许维持空间和实际上平面的类黄酮骨架。双键的饱和可能导致类黄酮结构中存在钝角。先前的研究结果假设类黄酮几乎平坦的结构是酶抑制活性的重要因素126。这些结论解释了芹菜素的抑制活性明显强于柚皮素（见表3）。
在双黄酮组中，检测了铜黄酮、阿曼黄酮、鲁布黄酮和大黄酮的抗弹性蛋白酶活性（图 4）76、84、85.Amentoflavone 和robustaflavone 的不同之处分别在于色烯环取代基C-8 和C-6。作者观察到它们的高抑制活性可能与游离羟基部分的最佳数量有关。值得一提的是，色烯环位置的区别并不影响双黄酮的生物效应。粗壮黄酮和大黄酮两种结构的差异与C环双键饱和有关。在 C-2 和 C-3 之间缺乏双键的 Rhusflavanone 表现出比鲁棒黄酮低得多的抑制潜力。该测定的结果与使用芹菜素和柚皮素的研究结果具有很好的相关性。
图 4.具有抗弹性蛋白酶潜力的双黄酮的化学结构。(A) Amentoflavone、(B) 鲁棒黄酮和 (C) 大黄酮。
B 环在 C 环中的位置使我们能够比较黄酮和异黄酮的活性。具有 3-B 环和一个 A 环上的羟基的染料木黄酮显示出与芹菜素相似的活性，而在 A 环上具有两个羟基的黄豆苷元表现出比黄酮更强的作用。然而，表 3中的数值不足以确定此类化合物的 SAR。
总之，IC50值的比较允许指出促进其弹性蛋白酶抑制的类黄酮结构的特征：B环的儿茶酚结构、C环的C2-C3之间的双键、A-、B的O-甲基化和C-糖基化- 和 C 形环。据报道，植物衍生物对 HNE 的活性水平也与这些衍生物的疏水性和摩尔折射率有关，双线性相关性代表最重要的关系128。然而，为了将 SAR 与类黄酮抑制作用联系起来，必须在不同的细胞和酶系统中进行额外的实验。
讨论和结论
在发现天然产物作为酶抑制剂方面取得了重大进展。天然化合物的高潜力在于它们作为先导结构的作用，可以在生物利用度和生物活性方面进行优化。然而，我们关于各种黄酮类化合物的 SAR 及其对弹性蛋白酶作用和释放的影响的知识仍然不完整。关于各类化合物活性的新报告提供了有关新型弹性蛋白酶抑制剂的信息。另一方面，现有的结果产生了关于其抑制活性水平的相互矛盾的信息。
为澄清起见，本综述的作者验证了确定表 3中化合物 IC50值的方法标准。例如，描述木犀草素活性的研究中IC50值之间的差异可能与涉及阻断中性粒细胞释放弹性蛋白酶以及抑制已经释放的酶的实验有关。有人指出，IC50木犀草素活性 > 300 µM 在测试中确定，它代表了在将酶添加到底物和孵育过程后测得的吸光度变化。相比之下，弹性蛋白酶的释放是通过嗜天青颗粒的脱粒和用 fMLP 激活人中性粒细胞来测量的。结果在 fMLP/CB（细胞松弛素 B）激活的无药物对照系统中表达。在这种情况下，木犀草素活性的 IC50达到 6.91 µM。相应地，另一种在植物界常见的黄酮，即芹菜素，已被测试为弹性蛋白酶抑制剂，其 IC50范围从 13.35 µM 到 46.1 µM。在用 fMLP 刺激细胞后，芹菜素会有效抑制 HNE 的释放。这些结果与使用木犀草素作为抑制剂获得的数据一致。据推断，涉及 fMLP/CB 刺激的中性粒细胞的实验表明芹菜素和木犀草素是有效的。对白杨素IC 50值的分析也可以得出类似的结论。人类嗜中性粒细胞中白杨素的优异活性被评估为抑制 fMLP/CB 诱导的弹性蛋白酶释放 (IC50=2.44 µM)。
槲皮素已在许多研究中用作参考化合物，已证明对弹性蛋白酶有抑制作用。基于这些结果，可以充分描述槲皮素 IC 50的值似乎在 2.6–2.65 µM 范围内。然而，一些研究人员为此化合物建立了超过 300 µM (0.101 mg/mL) 的阳性对照。在这种情况下，所得值之间的区别似乎与底物浓度（N-琥珀酰-Ala-Ala-Ala-p-硝基苯胺，弹性蛋白酶）、pH 值、孵育时间和温度以及弹性蛋白酶的体积有关，抑制剂和介质溶液。
此外，5,6,7-三羟基黄酮黄芩素不仅与胰弹性蛋白酶的活性位点结合，还与胰弹性蛋白酶的变构位点结合，表现出竞争性和非竞争性抑制模型，这表明抑制剂分子可能与酶中的任何一种结合。 -底物复合物或单独的酶80。根据现有数据，黄芩素具有显着的抗弹性蛋白酶作用（IC50=3.53 µM），尽管研究也表明缺乏相关的抑制活性。这些极端结果值之间的区别可能与所进行实验的不同条件有关。总之，为了指定抑制弹性蛋白酶活性或其从细胞中释放的能力，需要广泛的必要实验条件（包括底物、pH 水平、孵育时间、波长、体积、浓度以及酶释放或游离酶活性的抑制) 应予以考虑。
上述数据突出了天然酚类结构作为弹性蛋白酶抑制剂的多样性，因此表明可以基于酚类化合物的结构设计和开发新型合成抑制剂。在实践中，每种疗法的相当一部分是药物对其靶点的选择性。另一方面，化合物也可能由于其毒性和副作用而显示脱靶结果。抗靶向作用遵循功效和毒性剂量之间的狭窄水平，这引发了候选药物化合物开发的问题。可以用计算机建立蛋白质-配体相互作用评估虚拟筛选和对接。可用的理论技术提供了有关化合物的基本信息，并展示了计算其对 HNE 129、130 的结合亲和力的方法。结构形状虚拟筛选对于从数据库中识别选择性类黄酮抑制剂可能是实用的。分子对接是一种工具，可以预测潜在的抑制活性，并更好地表明类黄酮如何影响其酶靶标131。理论方法和计算程序，包括虚拟筛选、结构基础和药效团分析以及分子对接，可用于挑选靶向酶的化合物并确定已知和新发现的植物化学物质的预期目标132.因此，计算机研究可以改进连续阶段，以减少脱靶效应、活性分析和天然化合物的进一步分析。建议使用体内和体外确定所述抑制剂的功效和安全性，尤其是在产品中使用此类化合物以促进健康时。
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