本发明涉及医药学领域，特别是涉及一种三聚原花青素类化合物在制备防治帕金森病的药物的应用，所述的三聚原花青素类化合物具有如下化学结构式：
三聚原花青素类化合物的医药用途
技术领域
本发明涉及医药保健品领域，特别是涉及一种三聚原花青素类化合物的医药用途。
背景技术
帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是中老年人常见的神经系统变性疾病，在我国中老年人群的发病率仅次于阿尔茨海默病。主要临床特点为静止性震颤、动作迟缓及减少、肌张力增高、姿势不稳等，但病因迄今未明。一般认为是神经细胞的退行性变，最近研究发现神经炎性反应、线粒体缺陷、氧化应激、神经因子缺乏和异常蛋白α-synuclein聚集等多种因素都参与了帕金森病的病理机制。在我国65岁以上人群中PD患病率达到1.7％，已和欧美等发达国家无明显差异，且呈现逐年上涨趋势。PD严重威胁中老年人健康，降低患者的晚年生活质量，它的危害不容小觑。PD传统的治疗方法仍然是药物治疗，包括第一代抗胆碱能药、第二代左旋多巴和第三代多巴胺受体激动剂和增强剂。但是均不能从根本上治疗PD，不能延缓帕金森病情发展，且副作用较大。如最常用的左旋多巴替代治疗的效果一般在3-5年后衰退，病人也会出现以药源性运动障碍(异动症)为表现形式的多种副作用。因此，寻求高效低毒的防治PD的药物仍是世界医学界面临的一项艰巨任务和难题。
原花青素类成分具有多种生物活性，如富含原青花素类多酚的茶多酚制剂已广泛用于临床。三聚体原花青素类化合物属于低聚原花青素的范畴，是由三分子原花青素单位聚合而成(有A和B二种聚合形式。A型是指结构中有二个原花青素单位间通过C2-O-C7和C4-C8(C4-C6)两个键同时相连而成，其它原花青素单位间通过单键相连；B型是指所有原花青素单位间均通过单键相连)。低聚原花青素类成分的活性报道较少，单体低聚原花青素类化合物的活性报道更少。同时也未见三聚原花青素类化合物的帕金森病作用报道。
发明内容
本发明的目的旨在提供一种三聚原花青素类化合物的新的医药用途。
具体地说，本发明提供了一种三聚原花青素类化合物在制备防治帕金森病的药物的应用，所述的三聚原花青素类化合物具有如下化学结构式：
在一优选例中，所述的三聚原花青素类化合物是作为唯一的活性成分用于制备防治帕金森病的药物。
本发明各个方面的细节将在随后的章节中得以详尽描述。通过下文以及权利要求的描述，本发明的特点、目的和优势将更为明显。
具体实施方式
本发明的问世部分是基于这样一个意外发现：三聚原花青素类化合物在帕金森病的模型中可显著抑制脂多糖LPS诱导的炎症反应、降低神经毒素MPP+诱导的神经元损伤、减弱神经毒素MPTP引起的小鼠运动障碍等，因此，三聚原花青素类化合物可用于制备治疗帕金森病的药物。
本发明的三聚原花青素类化合物具有如下化学结构式：
本发明的三聚原花青素类化合物可从桂皮等植物中提取获得、通过商业途径购买获得或者通过化学方法合成获得。其纯度均符合药用标准。本发明的三聚原花青素类化合物的纯度以>98％最佳。
本发明的三聚原花青素类化合物可以单独使用或以药物组合物的形式使用。药物组合物包括作为活性成分的本发明的三聚原花青素类化合物及可药用载体。较佳地，本发明的药物组合物含有0.1-99.9％重量百分比的作为活性成分的本发明的三聚原花青素类化合物。“可药用载体”不会破坏本发明的三聚原花青素类化合物的药学活性，同时其有效用量，即能发挥药物载体作用时的用量对人体无毒。
所述可药用载体包括但不限于：软磷脂、硬脂酸铝、氧化铝、离子交换材料、自乳化药物传递系统、吐温或其他表面活化剂、血清蛋白、缓冲物质如磷酸盐、氨基乙酸、山梨酸、水、盐、电解质如硫酸盐精蛋白、磷酸氢二钠、磷酸氢钾、氯化钠、锌盐、硅酸镁、饱和脂肪酸部分甘油酯混合物等。
其他常用的药物辅料如粘合剂(如微晶纤维素)、填充剂(如淀粉、葡萄糖、无水乳糖和乳糖珠粒)、崩解剂(如交联PVP、交联羧甲基淀粉钠、交联羧甲基纤维素钠、低取代羟丙基纤维素)、润滑剂(如硬脂酸镁)以及吸收促进剂、吸附载体、香味剂、甜味剂、赋形剂、稀释剂、润湿剂等。
本发明的三聚原花青素类化合物以及其药物组合物可按本领域常规方法制备并可以通过肠道或非肠道或局部途径给药。口服制剂包括胶囊剂、片剂、口服液、颗粒剂、丸剂、散剂、丹剂、膏剂等；非肠道给药制剂包括注射液等；局部给药制剂包括霜剂、贴剂、软膏剂、喷雾剂等。优选为口服制剂。
本发明的三聚原花青素类化合物以及其药物组合物的给药途径可以为口服、舌下、经皮、经肌肉或皮下、皮肤粘膜、静脉、尿道、阴道等。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则所有的百分数、比率、比例、或份数按重量计。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
本发明提到的上述特征，或实施例提到的特征可以任意组合。本专利说明书所揭示的所有特征可与任何组合物形式并用，说明书中所揭示的各个特征，可以任何可提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明，所揭示的特征仅为均等或相似特征的一般性例子。
实施例1化合物Cinnamtannin B-1(CAS号：88082-60-4)的制备
将1.0kg荔枝壳，用5L的95vol％的乙醇水溶液进行回流提取，每次回流1小时，共回流提取3次，合并提取液，减压浓缩得浸膏(约800mL)；向该浸膏中加1倍量水混悬后，依次用石油醚(800mL×3)和乙酸乙酯(1000mL×3)萃取，收集乙酸乙酯萃取液；减压回收乙酸乙酯后进行硅胶柱层析，依次用石油醚和乙酸乙酯进行梯度洗脱，分段接收，合并，得10个流分；各流分再用硅胶柱层析、反相硅胶柱层析分离，最后用Sephadex LH-20纯化，即得化合物Cinnamtannin B-1。
Cinnamtannin B-1的特征：Cinnamtannin B-1(CB1，epicatechin-(4β→8,2β→O→7)-epicatechin-(4β→8)-epicatechin)浅棕色无定形粉末，香兰素-浓硫酸显橘红色。ESI-MS(pos.):865[M+H]+,ESI-MS(neg.):863[M-H]-,分子量:864，分子式:C45H36O18,A-typeOPC三聚体。1H NMR(500MHz,Methanol-d4)δ:3.28(1H,d,J＝3.5Hz,H-C3),4.15(1H,d,J＝3.5Hz,H-C4),5.96(1H,d,J＝2.3Hz,H-A6),6.01(1H,d,J＝2.3Hz,H-A8),7.03(1H,d,J＝2.0Hz,H-B2'),6.82(1H,d,J＝8.1Hz,H-B5'),6.73(1H,d,J＝1.6Hz,H-B6'),5.70(1H,s,H-F2),4.12(1H,s,H-F3),4.56(1H,s,H-F4),5.80(1H,s,H-D6),7.31(1H,d,J＝2.0Hz,H-E2'),6.83(1H,d,J＝8.0Hz,H-E5'),7.19(1H,d,J＝2.0Hz,H-E6'),4.38(1H,s,H-I2),3.86(1H,s,H-I3),2.84(2H,m,H-I4),6.10(1H,s,H-G6),6.82(1H,d,J＝1.7Hz,H-H2'),6.85(1H,d,J＝8.0Hz,H-H5'),6.78(1H,d,J＝1.7Hz,H-H6')；13C NMR(125MHz,Methanol-d4)δ:100.0(C-C2),67.2(C-C3),28.9(C-C4),156.7(C-A5),98.3(C-A6),157.6(C-A7),96.4(C-A8),154.1(C-A9),105.1(C-A10),132.0(C-B1'),115.9(C-B2'),145.8(C-B3'),145.5(C-B4'),116.1(C-B5'),119.9(C-B6'),78.8(C-F2),72.7(C-F3),38.3(C-F4),156.1(C-D5),96.1(C-D6),151.7(C-D7),106.7(C-D8),152.0(C-D9),106.6(C-D10),132.5(C-E1'),116.9(C-E2'),145.6(C-E3'),145.8(C-E4'),116.1(C-E5'),121.1(C-E6'),80.3(C-I2),67.8(C-I3),30.1(C-I4),155.6(C-G5),96.5(C-G6),155.9(C-G7),108.8(C-G8),155.4(C-G9),100.1(C-G10),132.9(C-H1'),116.5(C-H2'),146.6(C-H3'),146.3(C-H4'),116.1(C-H5'),119.3(C-H6')。以上波谱数据同文献[J Agric Food Chem,2007,55:5484-5490；Fitoterapia,2012,83:1210-1217]报道一致。
实施例2化合物Cinnamtannin D-1(CAS No.97233-60-2)的制备
将10.0kg天竺桂药材，用6L的70vol％的乙醇水溶液进行回流提取，每次超声提取1小时，共提取3次，合并提取液，减压浓缩得浸膏(约10000mL)；向该浸膏中加1倍量水混悬后，依次用石油醚(8000mL×3)和乙酸乙酯(8000mL×6)萃取，收集乙酸乙酯萃取液；减压回收乙酸乙酯后进行硅胶柱层析，依次用石油醚和乙酸乙酯进行梯度洗脱，分段接收，合并，得17个流分；各流分再用硅胶柱层析、反相硅胶柱层析分离，最后用Sephadex LH-20纯化，即得化合物Cinnamtannin D-1。
Cinnamtannin D-1的特征：Cinnamtannin D-1(CD1，epicatechin-(4β→8,2-O-7)-epicatechin(4β→8)-catechin)浅黄色无定形粉末，香兰素-浓硫酸显橘红色。ESI-MS(pos.):865[M+H]+,ESI-MS(neg.):863[M-H]-,分子量:864,分子式:C45H36O18,A-type OPC三聚体。1H NMR(500MHz,Methanol-d4)δ:3.46(1H,d,J＝3.5Hz,H-C3),4.00(1H,d,J＝3.5Hz,H-C4),5.94(1H,d,J＝2.3Hz,H-A6),6.01(1H,d,J＝2.3Hz,H-A8),7.09(1H,d,J＝2.1Hz,H-B2'),6.86(1H,d,J＝7.8Hz,H-B5'),6.95(1H,dd,J＝8.3/2.1Hz,H-B6'),5.51(1H,s,H-F2),4.05(1H,s,H-F3),4.53(1H,s,H-F4),5.84(1H,s,H-D6),7.23(1H,d,J＝1.8Hz,H-E2'),6.84(1H,d,J＝7.6Hz,H-E5'),7.08(1H,dd,J＝8.1/1.9Hz,H-E6'),3.95(1H,d,J＝9.1Hz,H-I2),3.67(1H,m,H-I3),3.05(1H,dd,J＝16.1/6.2Hz,H-I4),2.42(1H,dd,J＝16.0/10.1Hz,H-I4),6.10(1H,s,H-G6),6.75(1H,s,H-H2'),6.76(1H,d,J＝8.0Hz,H-H5'),6.66(1H,dd,J＝8.2/1.7Hz,H-H6')；13C NMR(125MHz,Methanol-d4)δ:100.1(C-C2),67.2(C-C3),28.9(C-C4),156.7(C-A5),98.4(C-A6),157.8(C-A7),96.5(C-A8),154.2(C-A9),105.0(C-A10),132.5(C-B1'),115.8(C-B2'),145.8(C-B3'),146.7(C-B4'),116.5(C-B5'),120.7(C-B6'),78.7(C-F2),72.5(C-F3),38.3(C-F4),156.7(C-D5),96.1(C-D6),151.1(C-D7),106.3(C-D8),151.8(C-D9),106.3(C-D10),131.5(C-E1'),115.9(C-E2'),145.9(C-E3'),146.3(C-E4'),116.1(C-E5'),121.1(C-E6'),83.3(C-I2),70.1(C-I3),30.7(C-I4),155.6(C-G5),96.5(C-G6),155.9(C-G7),108.8(C-G8),155.4(C-G9),101.8(C-G10),132.7(C-H1'),115.7(C-H2'),146.0(C-H3'),145.5(C-H4'),116.2(C-H5'),120.0(C-H6')。以上波谱数据同文献[J Agric Food Chem,2007,55:5484-5490；Fitoterapia,2012,83:1210-1217]报道一致。
实施例3化合物Procyanidin C1(CAS No.37064-30-5)的制备
将5.0kg肉桂药材，用40L的20vol％的乙醇水溶液进行提取，每次室温搅拌提取2小时，共提取3次，合并提取液，减压浓缩得浸膏(约3000mL)；向该浸膏中加1倍量水混悬后，依次用石油醚(4000mL×3)和乙酸乙酯(6000mL×3)萃取，收集乙酸乙酯萃取液；减压回收乙酸乙酯后进行硅胶柱层析，依次用石油醚和乙酸乙酯进行梯度洗脱，分段接收，合并，得20个流分；各流分再用硅胶柱层析、反相硅胶柱层析分离，最后用Sephadex LH-20纯化，即得化合物Procyanidin C1。
Procyanidin C1的特征：Procyanidin C1(PC1，epicatechin-(4β→8)-epicatechin-(4β→8)-epicatechin)浅红棕色无定形粉末，香兰素-浓硫酸显橘红色。ESI-MS(pos.):867[M+H]+,ESI-MS(neg.):865[M-H]-,分子量:866，分子式：C45H38O18，B-type OPC三聚体。1H NMR(500MHz,Methanol-d4)δ:5.08(1H,s,H-C2),4.02(1H,s,H-C3),4.72(1H,s,H-C4),6.02(1H,d,J＝2.1Hz,H-A6),6.05(1H,d,J＝2.1Hz,H-A8),6.94(1H,d,J＝2.1Hz,H-B2'),6.77(1H,d,J＝8.0Hz,H-B5'),6.71(1H,dd,J＝8.0/2.1Hz,H-B6'),5.23(1H,s,H-F2),4.03(1H,s,H-F3),4.74(1H,s,H-F4),6.01(1H,s,H-E6),7.03(1H,d,J＝8.1Hz,H-D2'),6.76(1H,d,J＝2.1Hz,H-D5'),6.73(1H,d,J＝2.1Hz,H-D6'),4.98(1H,s,H-I2),4.33(1H,s,H-I3),2.82(1H,d,J＝16.0Hz,H-I4),2.96(1H,dd,J＝16.0/4.0Hz,H-I4),5.94(1H,s,H-G6),7.13(1H,d,J＝2.0Hz,H-H2'),6.77(1H,d,J＝8.0Hz,H-H5'),6.92(1H,d,J＝2.2Hz,H-H6')；13C NMR(125MHz,Methanol-d4)δ:77.2(C-C2),73.4(C-C3),37.3(C-C4),157.9(C-A5),96.2(C-A6),158.3(C-A7),96.6(C-A8),157.9(C-A9),101.4(C-A10),132.6(C-B1'),115.3(C-B2'),145.8(C-B3'),145.5(C-B4'),116.0(C-B5'),119.3(C-B6'),77.1(C-F2),72.9(C-F3),37.4(C-F4),156.5(C-E5),97.1(C-E6),156.6(C-E7),107.2(C-E8),154.6(C-E9),101.4(C-E10),132.6(C-D1'),115.1(C-D2'),145.9(C-D3'),145.5(C-D4'),115.9(C-D5'),118.7(C-D6'),79.7(C-I2),66.8(C-I3),29.8(C-I4),156.8(C-G5),97.6(C-G6),156.8(C-G7),107.6(C-G8),154.6(C-G9),100.4(C-G10),132.0(C-H1'),115.0(C-H2'),145.9(C-H3'),145.7(C-H4'),115.7(C-H5'),119.1(C-H6')。以上波谱数据同文献[Fitoterapia,2012,83:1210-1217；Food Funct,2014,5:2298]报道一致。
实施例4用MTT法检测CB1,CD1,PC1对神经毒素MPP+诱导的神经元细胞的损伤的保护作用
对照组：DMEM/F12培养液
模型组：1mM MPP+处理细胞24h
样品组：用DMSO溶剂对CB1,CD1,PC1化合物配制成浓度为12.5μg/mL溶液，预处理细胞1h，之后加入4mM MPP+处理细胞24h
将人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)与各实验组样品分别培养24h，在培养结束前4h加入MTT溶液(5mg/mL)。培养结束后，吸去培养上清150μL，再加150μL DMSO溶解甲臜颗粒，低速摇床10min，用酶标仪于570nm处读取OD值。
表1 CB1,CD1,PC1对神经毒素MPP+诱导的神经元细胞的损伤的保护作用(％control,Mean±SEM,n＝8)
| 实验组 | n | 细胞增值(％control) |
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| 对照组 | 8 | 100±4.2*** |
| MPP<sup>+</sup> | 8 | 44.7±3.7 |
| MPP<sup>+</sup>+CB1 | 8 | 66.8±3.6*** |
| MPP<sup>+</sup>+CD1 | 8 | 68.35±5.5*** |
| MPP<sup>+</sup>+PC1 | 8 | 61.8±4.6*** |
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实验各组和模型组比较***P<0.001.
结论：CB1，CD1，PC1可以显著减少MPP+诱导的SH-SY5Y细胞死亡。
实施例5用Griess法检测CB1,CD1,PC1对脂多糖LPS诱导的小鼠神经小胶质细胞(BV2)的一氧化氮NO释放的保护作用
对照组：DMEM培养液
模型组：0.1ug/ml LPS处理细胞12h
样品组：用DMSO溶剂对CB1,CD1,PC1化合物配制成浓度为12.5μg/mL溶液，预处理细胞1h，之后加入0.1ug/ml LPS处理细胞12h
将小鼠神经小胶质细胞(BV2)与各实验组样品分别共培养12h后取出80μl培养基上清，加入等体积的Griess试剂，室温放置20分钟。用酶标仪于540nm处读取OD值。
表2 CB1,CD1,PC1对脂多糖LPS诱导的小胶质细胞的一氧化氮NO释放的抑制作用(％control,Mean+SEM,n＝8)
| 实验组 | n | NO释放(％control) |
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| 对照组 | 8 | 100±8.3*** |
| LPS | 8 | 2767±118.2 |
| LPS+CB1 | 8 | 2108±30.8*** |
| LPS+CD1 | 8 | 2352±54.9* |
| LPS+PC1 | 8 | 2361±174.1* |
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实验各组和模型组比较*P<0.05,***P<0.001.
结论：CB1，CD1，PC1可以显著降低LPS诱导的BV2细胞炎性反应。
实施例6小鼠爬杆实验测定CB1,CD1,PC1对神经毒素MPTP诱导的小鼠运动协调障碍和中脑黑质多巴胺能神经元的损伤缺失的改善作用
动物分组：选择25只成年野生型小鼠随机分为5组，分别为对照组(生理盐水注射)，MPTP组(MPTP，25mg/kg,i.p.连续5天)，MPTP+CB1组(CB1 150mg/kg灌胃连续19天+MPTP25mg/kg，i.p.连续5天)，MPTP+CD1组(CD1 150mg/kg灌胃连续19天+MPTP 25mg/kg，i.p.连续5天)MPTP+PC1组(PC1 150mg/kg灌胃连续19天+MPTP 25mg/kg，i.p.连续5天)。
小鼠爬杆试验：在一50厘米长、直径为1厘米的垂直木杆顶端放一小球，记录小鼠后肢离开球到前肢着地的时间。
黑质多巴胺能神经元测定：用酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase,TH)免疫组化染色对多巴胺能神经元进行标记，并测定阳性多巴胺能神经元数量的变化。
表3 CB1,CD1,PC1对神经毒素MPTP诱导的小鼠运动协调障碍的保护作用(％control,Mean±SEM,n＝5)
| 实验组 | n | 小鼠爬杆时间(S) |
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| 对照组 | 5 | 5±0.3*** |
| MPTP | 5 | 8.8±0.2 |
| MPTP+CB1 | 5 | 5.8±0.2*** |
| MPTP+CD1 | 5 | 6.6±0.5** |
| MPTP+PC1 | 5 | 6.0±0.3*** |
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实验各组和模型组比较**P<0.01,***P<0.001.
表4 CB1,CD1,PC1对神经毒素MPTP诱导的黑质阳性多巴胺能神经元死亡的保护作用(％control,Mean±SEM,n＝5)
| 实验组 | n | 阳性多巴胺能神经元数量 |
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| 对照组 | 5 | 69±2.1*** |
| MPTP | 5 | 28±2.9 |
| MPTP+CB1 | 5 | 51±3.8*** |
| MPTP+CD1 | 5 | 45±1.9** |
| MPTP+PC1 | 5 | 51±2.8*** |
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实验各组和模型组比较**P<0.01,***P<0.001.
结论：CB1，CD1，PC1可以显著缓解MPTP诱导的小鼠运动协调障碍和黑质阳性多巴胺能神经元缺失。
由此可见，本发明的三聚原花青素类化合物在帕金森病的体内外模型中可显著抑制LPS诱导的炎症反应，降低神经毒素MPP+诱导的神经元损伤，减弱神经毒素引起的小鼠运动障碍和黑质阳性多巴胺能神经元缺失。可望作为活性成分用于制备治疗帕金森病的药物，具有药用价值。
本发明所涉及的多个方面已做如上阐述。然而，应理解的是，在不偏离本发明精神之前提下，本领域专业人员可对其进行等同改变和修饰，所述改变和修饰同样落入本申请所附权利要求的覆盖范围。
