可可提取物及其制备方法

实施例1：

可可来源和制备方法几个Theobroma cacao属型是从世界的三个主要可可产地获得的，它们代表了可可的三个公认的园艺种类(Enriquez，1967；Engels，1981)。表1列出了本研究中所用的属型。剥开收获的可可豆荚取出带果肉的豆用于冻干。从冻干的团块中手工除去果肉，豆被用于下面的分析。首先对未发酵的冻干的可可豆进行手工去壳，用TEKMAR磨粉碎成细粉末，然后用重蒸的己烷作溶剂通过Soxhlet萃取进行过夜脱脂。残留的溶剂在环境温度下用真空除去。

表1：Theobroma cacao来源材料的描述

实施例2：

原花青素的提取方法A方法1用Jalal和Collin所描述的方法(1977)的改进方法，从实施例1的脱脂、未发酵、冻干的可可豆中提取原花青素。

原花青素是从50克脱脂的可可中提取的，先用2×400ml 70％的丙酮/去离子水，然后用400ml70％甲醇/去离子水。合并提取物，溶剂在旋转蒸发器中在45℃半真空的条件下蒸发掉。获得的水相用1L的去离子水稀释，用2×400ml CHCl3萃取，去掉溶剂相。然后用4×500ml的醋酸甲酯对水相进行萃取，通过Sorvall RC 28S离心机，在10℃2000×g的条件下离心30分钟破坏乳浊液，把100-200ml的去离子水加到混合的醋酸甲酯提取物中，溶剂在旋转蒸发器中在45℃半真空的条件下蒸发掉，获得的水相部分在液氮中冷冻，然后在LABCONCO冻干系统中冻干。表2中列出了从不同的可可属型中获得的粗原花青素的量。

表2：粗提原花青素的量

B方法2另外，可用70％的丙酮水溶液从实施例1的脱脂、未发酵、冻干的可可豆中提取原花青素。10克脱脂物和100ml溶剂调和5-10分钟，将浆液在4℃3000×g的条件下离心15分钟，上清过玻璃毛柱。滤液在半真空下蒸馏，所得水相在液氮中冷冻，然后在LABCONCO冻干系统中冻干。所得粗提原花青素的范围为15-20％。

不希望被任何具体理论所束缚，可以相信粗提物量的不同反应了不同属型、产地、园艺种类和制备方法的不同。

实施例3：

可可原花青素的部分纯化A凝胶渗透色谱用葡聚糖LH-20(28×2.5cm)液相色谱对实施例2中得到的原花青素进行部分纯化。分离通过从去离子水到甲醇的梯度进行。最初的梯度液从溶于去离子水的15％甲醇开始，然后每30分钟用溶于去离子水的25％甲醇、溶于去离子水的35％甲醇、溶于去离子水的70％甲醇、最后用100％的甲醇。收集黄嘌呤、生物碱(咖啡因和可可碱)的洗提物作为单一级分，从该级分中分离出无黄嘌呤生物碱的细级分，该细级分进一步分离得到五个细级分，标记为MM2A-MM2E。每一细级分中的溶剂被旋转蒸发器在45℃半真空的条件下蒸发掉，获得的水相部分在液氮中冷冻，然后在LABCONCO冻干系统中过夜进行冻干。图1给出了级分的典型凝胶渗透色谱。用这种方法大致细分离了100mg物质。

图1：粗提原花青素在葡聚糖LH-20的凝胶渗透色谱色谱条件：柱：28×2.5cm葡聚糖LH-20；流动相：甲醇/水，梯度15∶85，25∶75，35∶65，70∶30，100∶0，每隔半小时一步；流速：1.5ml/min检出：UV@λ1＝254nm，λ2＝365nm；记录速度：0.5mm/ml；柱载：1120mg。

B.半制备高效液相色谱(HPLC)方法1：反相分离从实施例2和/或3A中获得的原花青素通过半制备HPLC进行部分分离。惠普(Hewlett Packard)1050HPLC系统装有不同波长的检测器，带有1ml注射环的Rheodyne 7010注射阀和Pharmacia FR AC-100收集器装配在一起。在联有Phenomenex 10μODS Ultracarb保护柱(60×10mm)的Phenomenex Ultracarb 10μODS柱(250×22.5mm)上进行分离。流动相的组合物是A＝水；B＝甲醇，应用以下线性梯度：[时间，％A]；(0，85)，(60，50)，(90，0)，(110，0)，流速为5ml/min。

图15N给出了从级分D+E中分离原花青素的典型半制备HPLC的迹线。每隔一定的时间或手控收集单个峰或所选色谱区域的级分，进行进一步提纯和定性。注射负载范围是25-100mg。

方法2：正相分离从实施例2和/或3A中获得的原花青素通过半制备HPLC进行部分分离。惠普1050HPLC系统，设置在254nm的480型微孔-水LC检测器与设置在峰值的Pharmacia Frac-100收集器装配在一起。在联有Supelco5μLC-Si保护柱(20×4.6mm)的Supelco 5μSupelcosil LC-Si柱(250×10mm)上进行分离。按下列条件用线性梯度洗脱液进行洗脱：(时间，％A，％B)；(0，82，14)，(30，67.6，28.4)，(60，46，50)，(65，10，86)，(70k，10，86)，随后进行重新平衡10分钟。流动相的组合物是A＝二氯甲烷；B＝甲醇∶C＝醋酸∶水(1∶1)，流速为3ml/min。用波长为254nm的紫外检测，在Kipp@Zonan BD41记录器上记录。注射体积范围是10mg的原花青素100-250μl，该提取物溶于0.25ml 70％的丙酮水溶液中。图15O给出了其典型半制备HPLC迹线。每隔一定的时间或手控收集单个峰或所选色谱区域的级分，进行进一步提纯和定性。

HPLC条件：250×10mm Supelco Supelcosil LC-Si(5μm)半制备柱20×4.6 Supelco Supelcosil LC-Si(5μm)保护柱检测器：Waters 480型LC分光光度计，波长254nm流速：3毫升/分柱温：环境温度进样：70％丙酮水溶液提取物250μl。

<p>获得的级分如下：<

>实施例4：

分析HPLC对原花青素提取物的分析方法1：反相分离从实施例3得到的原花青素提取物通过0.45μ的滤器进行过滤，用惠普1090三元(ternary)HPLC系统进行分析，该系统配有二极管阵列检测器和1046A型HP程序荧光检测器。用惠普5μHypersil ODS柱在45℃进行分离。黄酚和原花青素用60％B-A的线性梯度洗脱液进行洗脱，用B以0.3ml/min的流速洗柱。流动相的组合物是B＝用甲醇配置的0.5％醋酸，A＝用去离子水配置的0.5％醋酸。A、B流动相中的醋酸可增到2％。级分用荧光检测，λex＝276nm、λem＝316nm。可参照标准溶液确定(+)-儿茶素和(-)-表儿茶素的浓度。根据(-)-表儿茶素的反应指数估计原花青素的水平。图2A给出了一种可可属型不同级分分离时的典型HPLC色谱。从其它的可可属型中也可得到相似的HPLC曲线。

HPLC条件：柱：200×2.1mm惠普Hypersil ODS(5μ)保护柱：20×2.1mm惠普Hypersil ODS(5μ)检测器：二极阵列管280nm荧光λex＝276nm、λem＝316nm流速：0.3ml/min

柱温：45℃

方法2：正相分离从实施例2和/或3得到的原花青素提取物通过0.45μ的滤器进行过滤，用惠普1090 II HPLC系统进行分析，该系统配有二极管阵列检测器和1046A型HP程序荧光检测器。在联有Supelco Supelguard LC-Si5μ保护柱(20×4.6mm)的5μPhenomenx Lichrosphere Silica 100 LC-Si柱(250×3.2mm)上，37℃时进行分离。按下列条件用线性梯度洗脱液进行洗脱：(时间，％A，％B)；(0，82，14)，(30，67.6，28.4)，(60，46，50)，(65，10，86)，(70k，10，86)，随后进行重新平衡8分钟。流动相的组合物是A＝二氯甲烷；B＝甲醇∶C＝醋酸∶水(1∶1)，流速为0.5ml/min。级分用荧光检测，λex＝276nm、λem＝316nm或用紫外在280nm检测。图2B给出了一种可可属型不同原花青素分离时的典型HPLC色谱。从其它的可可属型中也可得到相似的HPLC曲线。

HPLC条件：250×3.2mm Phenomenex Lichrosphere Silica 100柱(5μ)20×4.6mm Supelco Supelguard LC-Si(5μ)保护柱检测器：二极阵列管280nm荧光λex＝276nm、λem＝316nm流速：0.5ml/min柱温：37℃

实施例5：

原花青素的鉴定原花青素用交联葡聚糖LH-20(28×2.5cm)液相色谱进行纯化，随后用10μBondapak C18(100×8mm)柱半制备HPLC或5μSupelcosilLC-Si(250×10mm)柱半制备HPLC进行纯化。

特殊纯化的分离物用快速原子撞击-质谱法(FAB-MS)，在VGZAB-T高分辨MS系统中进行分析，该系统在阴阳离子态应用了液态二次离子质谱技术。用铯离子枪在30KV作电离源，“魔力子弹基质”(1∶1二硫苏糖醇/二赤藓糖醇)当作质子源。

用LSIMS对这些级分所进行的分析研究揭示出存在一些黄烷-3-酚寡聚物，如表3所示。

表3：

主要的质子碎片离子与以前用阴阳离子FAB-MS对原花青素所作的分析结果一致(Self等，1986和Porter等，1991)。与m/z 577(M+H)+相对应的离子和它在m/z599(M+Na)+的盐加成物说明在物中有双环原花青素二聚体存在。有趣的是与其说更高的寡聚物组成质子化了的分子离子(M+H)+不如说它组成盐加成物(M+Na)+。在Revila等(1991)，Self等(1986)和Porter等(1991)工作的基础上，对原花青素的异构体B-2，B-5和C-1进行了尝试性的鉴定。通过FAB-MS确定了，在特殊纯化级分中的原花青素达到八聚体和十聚体。此外，在HPLC正相色谱分析中得到原花青素达到十聚体的证据(图2B)。不希望被任何特殊理论所限制可以相信十聚体达到在萃取和纯化应用的溶剂中溶解度的极限。表4列出了在不含有黄嘌呤生物碱的分离物中发现的原花青素的相对浓度，这是在反相HPLC分析的基础上进行的。表4：不含有黄嘌呤生物碱的分离物中原花青素的相对浓度

</tables>表5：丙酮水溶液提取物中原花青素的相对浓度

</tables>

图3给出了原花青素的几个结构，图4A-4E给出了用于下面抗癌或抗肿瘤活性筛选的五个级分的典型HPLC色谱。以下是图4A-4B的HPLC条件：HPLC条件：惠普1090三元HPLC系统，配有1064A型HP可编程荧光检测器。柱：惠普5μHypersil ODS(200×2.1mm)线性梯度60％B-A，流速0.3ml/min。B＝甲醇配制的0.5％醋酸；A＝去离子水配制的醋酸；λex＝276nm、λem＝316nm。

图15O给出了用于抗癌或抗肿瘤活性筛选的12个额外级分的典型半制备HPLC色谱(色谱条件如上述)。