可可来源和制备方法几个Theobroma cacao属型是从世界的三个主要可可产地获得的,它们代表了可可的三个公认的园艺种类(Enriquez,1967;Engels,1981)。表1列出了本研究中所用的属型。剥开收获的可可豆荚取出带果肉的豆用于冻干。从冻干的团块中手工除去果肉,豆被用于下面的分析。首先对未发酵的冻干的可可豆进行手工去壳,用TEKMAR磨粉碎成细粉末,然后用重蒸的己烷作溶剂通过Soxhlet萃取进行过夜脱脂。残留的溶剂在环境温度下用真空除去。
原花青素的提取方法A方法1用Jalal和Collin所描述的方法(1977)的改进方法,从实施例1的脱脂、未发酵、冻干的可可豆中提取原花青素。
原花青素是从50克脱脂的可可中提取的,先用2×400ml 70%的丙酮/去离子水,然后用400ml70%甲醇/去离子水。合并提取物,溶剂在旋转蒸发器中在45℃半真空的条件下蒸发掉。获得的水相用1L的去离子水稀释,用2×400ml CHCl3萃取,去掉溶剂相。然后用4×500ml的醋酸甲酯对水相进行萃取,通过Sorvall RC 28S离心机,在10℃2000×g的条件下离心30分钟破坏乳浊液,把100-200ml的去离子水加到混合的醋酸甲酯提取物中,溶剂在旋转蒸发器中在45℃半真空的条件下蒸发掉,获得的水相部分在液氮中冷冻,然后在LABCONCO冻干系统中冻干。表2中列出了从不同的可可属型中获得的粗原花青素的量。
B方法2另外,可用70%的丙酮水溶液从实施例1的脱脂、未发酵、冻干的可可豆中提取原花青素。10克脱脂物和100ml溶剂调和5-10分钟,将浆液在4℃3000×g的条件下离心15分钟,上清过玻璃毛柱。滤液在半真空下蒸馏,所得水相在液氮中冷冻,然后在LABCONCO冻干系统中冻干。所得粗提原花青素的范围为15-20%。
不希望被任何具体理论所束缚,可以相信粗提物量的不同反应了不同属型、产地、园艺种类和制备方法的不同。
可可原花青素的部分纯化A凝胶渗透色谱用葡聚糖LH-20(28×2.5cm)液相色谱对实施例2中得到的原花青素进行部分纯化。分离通过从去离子水到甲醇的梯度进行。最初的梯度液从溶于去离子水的15%甲醇开始,然后每30分钟用溶于去离子水的25%甲醇、溶于去离子水的35%甲醇、溶于去离子水的70%甲醇、最后用100%的甲醇。收集黄嘌呤、生物碱(咖啡因和可可碱)的洗提物作为单一级分,从该级分中分离出无黄嘌呤生物碱的细级分,该细级分进一步分离得到五个细级分,标记为MM2A-MM2E。每一细级分中的溶剂被旋转蒸发器在45℃半真空的条件下蒸发掉,获得的水相部分在液氮中冷冻,然后在LABCONCO冻干系统中过夜进行冻干。图1给出了级分的典型凝胶渗透色谱。用这种方法大致细分离了100mg物质。
图1:粗提原花青素在葡聚糖LH-20的凝胶渗透色谱色谱条件:柱:28×2.5cm葡聚糖LH-20;流动相:甲醇/水,梯度15∶85,25∶75,35∶65,70∶30,100∶0,每隔半小时一步;流速:1.5ml/min检出:UV@λ1=254nm,λ2=365nm;记录速度:0.5mm/ml;柱载:1120mg。
B.半制备高效液相色谱(HPLC)方法1:反相分离从实施例2和/或3A中获得的原花青素通过半制备HPLC进行部分分离。惠普(Hewlett Packard)1050HPLC系统装有不同波长的检测器,带有1ml注射环的Rheodyne 7010注射阀和Pharmacia FR AC-100收集器装配在一起。在联有Phenomenex 10μODS Ultracarb保护柱(60×10mm)的Phenomenex Ultracarb 10μODS柱(250×22.5mm)上进行分离。流动相的组合物是A=水;B=甲醇,应用以下线性梯度:[时间,%A];(0,85),(60,50),(90,0),(110,0),流速为5ml/min。
图15N给出了从级分D+E中分离原花青素的典型半制备HPLC的迹线。每隔一定的时间或手控收集单个峰或所选色谱区域的级分,进行进一步提纯和定性。注射负载范围是25-100mg。
方法2:正相分离从实施例2和/或3A中获得的原花青素通过半制备HPLC进行部分分离。惠普1050HPLC系统,设置在254nm的480型微孔-水LC检测器与设置在峰值的Pharmacia Frac-100收集器装配在一起。在联有Supelco5μLC-Si保护柱(20×4.6mm)的Supelco 5μSupelcosil LC-Si柱(250×10mm)上进行分离。按下列条件用线性梯度洗脱液进行洗脱:(时间,%A,%B);(0,82,14),(30,67.6,28.4),(60,46,50),(65,10,86),(70k,10,86),随后进行重新平衡10分钟。流动相的组合物是A=二氯甲烷;B=甲醇∶C=醋酸∶水(1∶1),流速为3ml/min。用波长为254nm的紫外检测,在Kipp@Zonan BD41记录器上记录。注射体积范围是10mg的原花青素100-250μl,该提取物溶于0.25ml 70%的丙酮水溶液中。图15O给出了其典型半制备HPLC迹线。每隔一定的时间或手控收集单个峰或所选色谱区域的级分,进行进一步提纯和定性。
分析HPLC对原花青素提取物的分析方法1:反相分离从实施例3得到的原花青素提取物通过0.45μ的滤器进行过滤,用惠普1090三元(ternary)HPLC系统进行分析,该系统配有二极管阵列检测器和1046A型HP程序荧光检测器。用惠普5μHypersil ODS柱在45℃进行分离。黄酚和原花青素用60%B-A的线性梯度洗脱液进行洗脱,用B以0.3ml/min的流速洗柱。流动相的组合物是B=用甲醇配置的0.5%醋酸,A=用去离子水配置的0.5%醋酸。A、B流动相中的醋酸可增到2%。级分用荧光检测,λex=276nm、λem=316nm。可参照标准溶液确定(+)-儿茶素和(-)-表儿茶素的浓度。根据(-)-表儿茶素的反应指数估计原花青素的水平。图2A给出了一种可可属型不同级分分离时的典型HPLC色谱。从其它的可可属型中也可得到相似的HPLC曲线。
原花青素的鉴定原花青素用交联葡聚糖LH-20(28×2.5cm)液相色谱进行纯化,随后用10μBondapak C18(100×8mm)柱半制备HPLC或5μSupelcosilLC-Si(250×10mm)柱半制备HPLC进行纯化。
图15O给出了用于抗癌或抗肿瘤活性筛选的12个额外级分的典型半制备HPLC色谱(色谱条件如上述)。
联系客服