今天要精读的文献主要是向大家讲解下如何利用Oncomine分析基因表达,然后通过临床与生信,验证在nek2,肝癌,mir-486-5p三者关系。
Title: MiR-486-5p negatively regulates oncogenic NEK2 in hepatocellular carcinoma
首先看一下文章摘要,了解作者的整体思路。我们可以得到三方面的信息:
(1)数据库Oncomine中分析发现NEK2基因在肝癌(HCC)患者中高表达。
(2)NEK2可以促进肝癌细胞系增殖能力,克隆形成能力以及侵袭能力。体外成瘤实验
(3)mir-486-5p可以直接结合到NEK2的3'UTR区域,抑制其转录。
下面我们详细看一下作者是如何一步步进行实验设计以及得出结论的。文章整体呢,可以分四个部分。
第一部分
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通过 Oncomine 数据库分析发现NEK2在肝癌(HCC)患者中高表达(FIG1A), 然后作者通过q-PCR验证48对例肝癌组织与癌旁组织,NEK2mRNA 在肝癌组织明显高于癌旁组织(FIG2B)。
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然后作者选择多种肝癌细胞系,对NEK2进行mRNA以及蛋白水平的检测,发现在smmc- 7721细胞系中NEK2表达最高而在Huh7细胞系中表达最低(正常肝细胞株LO2)。因此,选择这两个细胞系进行下一步的实验。
第二部分
01
作者对100例患者的肝癌样品进行免疫组化实验检测NEK2的表达,发现可以将肝癌患者分为两组(1)NEK2高表达组。(2)NEK2低表达组。同时发现NEK2的表达与HBsAg,,肿瘤大小等因素相关。
02
然后作者进行Kaplan-Meier生存曲线分析,发现NEK2高表达,患者预后情况相对较差。
第三部分
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作者通过向 Huh7 细胞系转染 NEK2 质粒过表达 NEK2 表达水平; 向SMMC-7721细胞系转染 NEK2 shRNA质粒敲减NEK2表达。研究NEK2在肝癌发生进程中的作用。
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作者通过分析两株细胞系中克隆形成,迁移增殖实验发现:
(1)在SMMC-7721细胞系中敲减NEK2后,与对照组相比,细胞克隆形成数减少,迁移增殖能力降低(FIGC/FIGD/FIGE)。
(2)在Huh7细胞系中过表达NEK2后,与对照组相比,细胞克隆形成数增加,迁移增殖能力增强(FIGF/FIGG/FIGH)。
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体内实验
(1)作者通过裸鼠成瘤实验,发现SMMC-7721细胞系中敲减NEK2组,肿瘤体积明显减小;Huh7细胞系中过表达NEK2组,肿瘤体积明显增大。与体内实验结果一致。
(2)免疫组化实验发现,高表达NEK2组Ki67阳性率明显高于对照组。NEK2 促进肿瘤生成。
第四部分
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作者通过miRanda与miRDB数据库,预测可能调控NEK2的microrna, 得到两个miR-543 and miR-486-5p可能与NEK2的3’ UTR结合。2.然后作者通过荧光酶报告基因实验,证实miR-486-5p可以抑制NEK2的表达。
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作者通过荧光酶报告基因实验,证实miR-486-5p可以抑制NEK2的表达。然后作者通过检测正常组织与肿瘤组织中miR-486-5p表达水平,发现miR-486-5p在肿瘤组织中表达水平降低,同时发现,随着miR-486-5p表达水平降低,NEK2表达升高,肝癌患者预后越差。
整体来说,文章的亮点在于
(1)从 Oncomine 数据库出发,辅以临床验证。
(2)选择两种细胞系,分别进行过表达或者敲减,从正反两方面阐述基因的作用机制。
(3)在寻找基因作用机制时,通过 miRanda 与 miRDB 数据库,从靶基因出发,预测相应的 microRNA。
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