摘要
准确识别PARPi治疗有效的高级别浆液性卵巢癌（HGSOC）患者具有重要的临床意义。作者采用定量BRCA1甲基化分析为临床前模型和卵巢癌患者的PARPi治疗提供证据。评估12例HGSOC患者来源的异种移植物（PDX）对PARPi-Rucaparib的反应，BRCA1/2突变PDX中观察到剂量依赖性疗效，DNA修复途径缺陷PDX中Rucaparib没有疗效。在BRCA1甲基化PDX中，BRCA1拷贝沉默预测Rucaparib有效，杂合子甲基化与耐药相关。对21例BRCA1甲基化铂敏感性复发HGSOC（ARIEL2第1部分试验）分析证实，纯合或半合子BRCA1甲基化可预测Rucaparib的疗效，并且甲基化缺失可在化疗后发生。因此，在治疗前活组织检查BRCA1甲基化可以识别受益患者，有助于调整PARPi治疗策略。
背景
由于BRCA1或BRCA2（BRCA1 / 2）突变，PARPi在同源重组（HR）修复缺陷HGSOC中是有效的。 铂敏感复发高级别浆液性卵巢癌 PARPi维持治疗延长患者无进展生存期（PFS），一些患者持续受益超过3年。因此，PARPi现在被欧洲药品管理局（EMA）和美国食品药物管理局（FDA）批准用于复发性卵巢癌（OC）的维持治疗。PARPi也可能与BRCA1/2突变以外的同源重组DNA修复缺陷癌症的靶向治疗相关。在高级别卵巢癌中，由BRCA1/2突变引起的同源重组缺陷发生率为17-25%，约有¾是生殖细胞来源，¼是体细胞来源。同源重组缺陷包括基因RAD51C、RAD51D、PALB2（6-10%）突变、BRCA1（7-17%）或RAD51C（1.5-3%）启动子甲基化（不同于BRCA1/2突变）。
尽管PARPi有令人兴奋的临床疗效，但1/3 的BRCA1 / 2突变复发HGSOC患者未能从中获益， 即使患者对治疗反应，但大多数患者也会在12个月内复发。目前普遍接受的PARPi耐药机制是通过突变BRCA1 / 2基因发生次级体细胞突变恢复同源重组功能，导致框内基因重新转录。在HGSOC和前列腺癌中已经描述了恢复BRCA1 / 2和RAD51C / D突变与铂化疗和PARPi耐药相关。研究BRCA1 / 2突变（原发性或继发性）以外的HR缺陷，可以更准确地靶向PARPi治疗和消除PARPi耐药。
BRCA1启动子甲基化在20年前首次在乳腺癌中发现，随后在卵巢癌中报告。BRCA1转录起始位点CpG位点甲基化与BRCA1 mRNA和蛋白质的减少有关。因此，公认的BRCA1缺失机制之一是BRCA1一个等位基因甲基化合并另一个等位基因杂合性丢失（LOH）。BRCA1单一等位基因甲基化对治疗影响尚不清楚。最近基因组特征表明乳腺癌中BRCA1甲基化导致与BRCA1突变相同的HR缺陷。但是与BRCA1/2突变不同的是，目前还没有证明BRCA1甲基化对卵巢癌患者生存率有影响，多个研究未能观察到BRCA1甲基化分层后卵巢癌患者生存率改变。最近在一项三阴乳腺癌的临床试验中，与BRCA1/2突变相比，卡铂对BRCA1甲基化的受试者没有益处。
PARPi疗法曾被用于BRCA1甲基化的癌症。 BRCA1甲基化乳腺癌细胞系显示出PARPi敏感性; 去甲基化剂5-氮杂胞苷恢复BRCA1沉默和PARPi敏感性。在ARIEL2第1部分试验中，BRCA1甲基化与PARPi-rucaparib单药治疗反应呈弱相关，但尚不清楚哪些BRCA1甲基化病例会对治疗产生反应。相反，在铂化疗后PARPi维持治疗患者的研究中，没有发现长期应答者（>2年）存在BRCA1甲基化。因此，高级别浆液性卵巢癌患者BRCA1甲基化预测PARPi有效需要进一步验证。
因此，作者检测BRCA1（纯合子或半合子 VS 杂合子）甲基化状态对PARPi或铂化疗疗效影响，定义homozygous和 homozygosity为未甲基化的病例。结果显示OC细胞系和患者来源的异种移植物（PDX）对rucaparib反应取决于BRCA1甲基化。作者ARIEL2第1部分PARPi试验是关于HGSOC治疗前活检甲基化分析临床试验的首次报道，可获得BRCA1甲基化病例的治疗前活组织检查结果并证明BRCA1甲基化与rucaparib疗效相关。
结果
HGSOC PDX的基因组特征
对来自12名HGSOC患者的PDX进行组织学评估和WT1，PAX8和P53免疫组织化学染色证实PDX保留了HGSOC特征（图1a）。对HGSOC患者和PDX肿瘤DNA样品进行Foundation Medicine T5a测序和RNA测序。除了体细胞TP53突变外，还在4个HGSOC鉴定出BRCA1 / 2突变，其中一个被证实是生殖细胞系（＃56;图1b）。6例HGSOC中检测到中的RB1突变或缺失（＃56,19,11,169,27,80），1例HGSOC中检测到NF1缺失（＃80）和2例HGSOC中检测到CCNE1扩增（＃29，201）。HGSOC患者的RNA-seq分析证实了缺失基因的表达降低和扩增基因的高表达（图1c）。4例HGSOC除了BRCA1 / 2突变外，HGSOC和相应的PDX中还检测到BRCA1甲基化（＃11,62,48,169）。四种PDX为HR-DNA修复基因野生型（图1b）。
BRCA1 / 2突变PDX中剂量依赖性rucaparib反应
为了评估PARPi敏感性，在三种剂量水平（150,300或450mg kg-1）口服rucaparib，每周5天，持续3周。 BRCA1 / 2突变导致HR缺陷的四种PDX中有三种对rucaparib有反应。PDX＃19或＃56小鼠获得超过80天的肿瘤持久消退（图2a，b）。 观察到剂量依赖性反应，并且并非所有BRCA1 / 2突变体HGSOC PDX对PARPi都同样敏感（图 2a，b）。
四种BRCA1 / 2突变PDX中两种对150mg kg-1rucaparib有反应：PDX＃19和PDX＃56。化疗初期PDX＃ 13对300和450 mg kg-1 rucaparib有显着反应，PDX＃54具有致病性错义BRCA1 BRCT结构域突变（c.5095C> T，p.R1699W），是rucaparib耐药的，可能是由于HSP90介导突变BRCA1蛋白稳定化。在进一步的实验中，DNA测序未能在复发时检测这四种PDX中BRCA1或BRCA2的任何二次突变。
BRCA1甲基化PDXrucaparib反应
四种HR基因未突变和BRCA1启动子甲基化的PDX使用rucaparib肿瘤没有消退或稳定（图2c，d）。
MS-HRM和MS-ddPCR重新评估PDX的甲基化状态。包括BRCA1启动子7个甲基化CpG位点：MS-HRM（-37，-29，-21和-19）和ddPCR（ 14， 16和 19）。 观察到BRCA1两种甲基化模式：（i）BRCA1所有拷贝的纯合甲基化；（ii）杂合甲基化（图3a，b）。PDX（＃11和＃62）具有约100％的BRCA1甲基化，因此被指定为纯合状态。PDX（＃48和＃169）具有约50％的甲基化，因此被指定为杂合状态。体外RAD51病灶形成分析评估HR通路活性，结果显示PDX＃169 DNA损伤形成RAD51病灶，PDX＃169含有杂合甲基化，但在PDX＃11或PDX＃62中没有，这两者都含有纯合甲基化。 （图3c，d）。两例BRCA1纯合启动子甲基化中一例（＃62）对300mg kg-1 rucaparib有反应，七只小鼠中两只肿瘤消退（图3e）。 PDX＃62对顺铂具有抗性/难治性并且通过存在多个癌基因扩增表征。BRCA1纯合甲基化的另一种PDX（＃11），尽管对铂非常敏感，但在低剂量rucaparib（150mg kg-1）时对rucaparib无反应。 然而，PDX＃11来源的患者随后接受rucaparib单剂起始剂量为600 mg，每天两次，部分缓解（PR）为10个月（图3f，g），表明在PDX中，体内较高剂量的rucaparib治疗可能是有效的。相反，对于PDX48或169，两者都含有杂合子BRCA1启动子甲基化（图3h，i），在对rucaparib的反应中未观察到疾病稳定或肿瘤消退。
BRCA1-甲基化细胞系rucaparib反应
与BRCA1杂合子甲基化OVCAR8细胞系、HR活性OC细胞系OV90、正常永生化输卵管表皮细胞FT28241细胞系相比，BRCA1纯合子甲基化细胞系WEHICS62、OVCAR8的HR缺陷衍生细胞系（RAD51C-KO）在对红外损伤形成RAD51病灶的能力降低（图4a，b）。菌落形成和细胞增殖分析表明WEHICS62细胞、缺乏HR的OVCAR8细胞系衍生物（RAD51C-ko）和BRCA2突变OC细胞系peo142对Rucaparib敏感。BRCA1杂合子启动子甲基化Ovcar8细胞系和HR感受态PEO4 OC细胞系在体外对Rucaparib不敏感（图4c，d）。
HGSOC PDX的基因组特征
12例高级别浆液性卵巢癌中有8例在肿瘤治疗前活检中有纯合BRCA1甲基化，其中6例高度甲基化。 与BRCA1 / 2突变亚组（12.8个月，95％CI 9.0-14.7，n = 40）相比，BRCA1纯合子甲基化（高度）亚组的中位PFS为14.5个月（95％CI 4.8-18.3，n = 6）。 虽然没有统计学意义，但与BRCA1 / 2野生型非BRCA1甲基化病例（5.5个月，95％CI 5.0-6.2，p = 0.062，n = 143）相比，BRCA1高度纯合甲基化组的PFS更长（图5a）。所有纯合的BRCA1甲基化患者具有高LOH评分（> 16％），间接HR缺陷标记（图5b）。 纯合BRCA1-甲基化病例的平均LOH评分显着高于BRCA1 / 2野生型非BRCA1-甲基化病例（27.9 VS 15.9，p = 0.04）。 在纯合子BRCA1甲基化亚组和其他亚组之间，LOH评分没有显着差异（图5b）。与BRCA1 / 2野生型非BRCA1甲基化患者相比，高度BRCA1纯合子甲基化患者客观缓解率更好（6例中有5例缓解，缓解率 83％）（n = 143，p = 0.0014）。 BRCA1纯合甲基化组靶损伤大小较BRCA1 / 2野生型非BRCA1-甲基化病例显着减少（-53.9 VS -13.5％，p = 0.001，图5c，d）。BRCA1启动子纯合子甲基化患者更可能对rucaparib产生反应。
讨论
PDX模型的研究（肿瘤BRCA1启动子甲基化的定量评估）观察到纯合甲基化和BRCA1的完全沉默诱导HR缺陷和PARPi敏感性有关。作者采用高度定量的方法，并对肿瘤细胞数和BRCA1拷贝数进行调整，确定了BRCA1纯合子甲基化患者观察到改善的临床结果。研究首次阐明了BRCA1甲基化在癌症对PARPi反应中的关键作用，并具有潜在的重要临床意义。需要进一步开发和改进准确和有效分类BRCA1纯合甲基化状态的方法，以及适当的前瞻性临床试验验证纯合BRCA1甲基化预测PARPi敏感性。此外，化疗后BRCA1甲基化缺失强调了实时治疗前活检对评估甲基化作为复发性HGSOC患者治疗反应的预测因子的重要性。与BRCA1 / 2的二次突变一样，治疗中BRCA1甲基化缺失会使PARPi治疗失去作用，这表明早期引入PARPi治疗可能会减少耐药。
参考文献：Kondrashova, O., et al., Methylation of all BRCA1 copies predicts response to the PARP inhibitor rucaparib in ovarian carcinoma. Nat Commun, 2018. 9(1): p. 3970.
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