16S rRNA基因是原核生物所特有的基因，并且在原核生物中具有极高的拷贝数。全长1 542nt的DNA序列包含9个间隔的高变区，兼具特异性和保守性的16S rRNA基因序列作为微生物标记被广泛应用于研究中。相比DNA探针、变性梯度凝胶电泳和Sanger测序等方法，高通量测序技术在16S rRNA基因序列研究中体现出极大的优势。以Roche，Illumina等为代表的第二代测序技术将16S rRNA基因测序的通量大幅提高，为研究者提供对特定环境微生物进行全面分析的可能。目前，第二代测序技术已经成为环境微生物研究的主流手段。但是，第二代测序技术在16S rRNA基因测序中存在的缺陷也不可忽视——测序片段短。第二代测序平台中，测序片段最长的是Roche公司开发的454 GS FLX+测序仪，其测序片段长度仅为700 bp。过短的测序片段使得研究人员在微生物16S rRNA基因测序中，只能选择部分高变区进行研究，这对研究结果的准确性有较大影响。
目前PacBio测序仪的测序长度可达到20 000 bp，这为基于16SrRNA基因测序的微生物研究提供更好的选择。本文将为大家总结PacBio的SMRT测序技术在全长16S rRNA的成功应用，最后提出目前存在的问题和可能的解决方案，以期为研究人员采用SMRT测序技术研究微生物16S rRNA基因提供参考。
利用Pacbio全长16S扩增子测序评估婴儿配方食品安全性研究方法
对30个婴儿奶粉样品（12份国产，18份进口）进行PacBio全长16S扩增子测序，测序平台：PacBio RS Ⅱ，试剂：P6C4。
结果分析
1，微生物多样性及相对丰度分析
“种”水平的微生物多样性分析及相对丰度（相对丰度>1%）
2，国产和进口奶粉的优势菌株存在差异
国产配方奶粉以Lactococcuspiscium(27.78%)和Lactococcus lactis(17.16%)为主。分析进口婴儿配方奶粉的优势菌株，1群以Streptococcus thermophilus(65.55%)为主，4群以Lactococcus piscium(27.04%)为主，2群和3群以Streptococcus thermophilus、Lactococcus lactis 和 Lactococcus piscium为主。
30个样本“种”水平的微生物丰度
3，预热处理和杆菌相对含量之间的关系
通过乳清蛋白氮指数（whey protein nitrogen index，WPNI)可检测乳品中乳清蛋白的变性度，反应乳品的热处理程度。本研究将样品微生物群落“属”水平上的相对丰度结合WPNI进行分析，结果表明，预热处理的温度与芽孢杆属（Bacillussp.）丰度负相关，与链球菌属（Streptococcus sp.）和乳酸菌属（Lactobacillus sp.）正相关。
利用Pacbio全长16S扩增子测序于健康奶牛与乳房炎奶牛肠道菌群定量与宏基因组研究
牛场管理、病原菌感染和奶牛体质等因素都可能造成奶牛乳房炎（体温升高，乳房红肿痛，体细胞数（SCC）升高，牛乳呈棕黄色，脓浆），导致巨额经济损失、增加细菌耐药性、抗性基因污染，最终威胁食品安全。因此对益生乳酸菌在奶牛养殖中应用研究具有重要意义
研究方法
选取健康组(CH，20头 ，SCC< 30万/ml)，乳房炎组(cm，20头，=""scc="">100万/mL) ，采用二代、三代测序技术相结合的方法从宏基因组角度完成了40头奶牛粪便中微生物多样性和Metagenome分析，探究揭示乳腺炎与奶牛肠道微生物及功能基因的关系。
结果
基于三代测序技术完成健康组、乳房炎患病组共40头奶牛肠道微生物组成分析，共识别出319个细菌种，平均相对含量在0.1%以上的菌种共有28个。其中蝙蝠弧菌属Vampirovibrio在乳房炎组含量高，该菌可引起轻度腹泻与红细胞溶血。真杆菌属Eubacterium，颤螺旋菌属Oscillibacter等产酸菌在健康组含量较高。α多样性分析结果与Mann-Whitney检验发现，健康组微生物物种丰度和多样性显著高于乳房炎组，乳房炎组奶牛肠道微生物结构趋于简单化。
利用Pacbio全长16S扩增子测序以评估苜蓿青贮的质量
苜蓿是畜牧业中重要的饲料作物，它包含很多牲畜生长所需的物质，如蛋白质、维生素和矿物质等，目前保存的方法就是青贮法，在贮藏时一般会加入乳酸菌促进发酵过程。随着SMRT技术长读长优势显现，研究者通过SMRT测序对四个样本添加产乳酸菌发酵前后的微生物菌落进行了研究。
实验方法
四种以乳酸菌为基础的添加剂处理苜蓿青贮；发酵过程中，添加剂有利于降低pH值和霉菌毒素，而增加有机酸；SMRT分析8个发酵后样本，细菌种类和丰度显著上升；在原料中，巨大芽孢杆菌是起始优势物种，经过发酵后，添加剂中存在的乳酸片球菌和植物乳杆菌成为优势物种。
研究结果
1，所有样本中共鉴定到960种细菌，其中12种细菌含量均大于1%；
2，发酵前后物种数和相对丰度变化很大；
3，发酵后饲料中的微生物组成与所添加的菌群有很大关系，基于UniFrac的PCoA分析显示发酵前和发酵后的样本组成差异很大。
发酵前后的微生物菌落比较
以上各项成果均提及到一项技术服务-Pacbio测序应用于微生物群落分析，那么，PacBio SMRT测序在微生物群落分析中的优势有哪些？
PacBio平台测序产生PhyloTags的过程中不需要扩增，相较于其他测序平台降低了测序平台的特异性偏差；
PacBio平台测序产生的PhyloTags具有超高的一致准确性，并且能够真实反映微生物的高GC/低GC区，不会产生扩增偏好性。
PacBio公司正在努力改进提高测序正确率，目前的P6-C4试剂的平均正确率可达86%以上，读长可达12Kb。随着时间的推移，使用PacBio测序的16s指标将逐渐达到Sanger扩增子的水平。
关于TBC
天津生物芯片三代测序平台自2013年运行至今，作为国内比较早一批提供三代测序服务的机构，现已形成以PacBio单分子测序RSII和Sequel“双核”平台为中心，现已成功利用三代测序技术完成细菌、真菌、昆虫、动植物、人类等数百个物种的基因组、全长转录组测序及分析工作，并开发建立了基于三代测序技术的靶向测序、宏基因组测序、表观遗传测序、以及单细胞测序系列方案。 2003年至今，累计为客户在国际权威期刊发表SCI论文178篇，其中包括：Nature、NatureCommunication、PNAS、FEMSMicrobiol Rev PLoS Genetics。
欢迎致电022-66229538 或发邮件tjbiochipmk@126.com进行咨询TBC 16S全长测序服务！
参考文献
1. Y. Zheng, etal., Using PacBioLong-Read High-Throughput Microbial Gene Amplicon SequencingTo Evaluate InfantFormula Safety. J Agric Food Chem (2016)
2，Weichen , etal.,BaoAssessing quality ofMedicago sativa silage by monitoring bacterial composition with singlemolecule, real-time sequencing technology and various physiologicalparameters. Scientific Report(2016)
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