上一篇简单的介绍了Biacore 的基本原理及应用（利用 BIAcore 分析相互作用的蛋白质（上篇）——原理和应用, 点我查看哦），也许有同志会说，咱有钱，交给公司做吧，但实际情况是，公司的科研狗们看着这几个技术头也要疼死了，不一定做得结果来。Biacore 我们粗略的知道了它好用，但还是没有尝到甜头，今天分享一个实战的例子。
所谓磨刀不误砍柴工，在正式实验开始前我们往往都会摸索合适条件，条件到位了，但这个技术要注意两个问题：蛋白纯度和非特异性吸附。
首先，我们拿到两个纯度95%的蛋白后，要确定配体和分析物，如果两个都是蛋白，这个配体和分析物可以先随意固定一个。如果是验证蛋白和核酸，有专门的SA芯片，核酸作为配体先偶联在芯片上，这时蛋白就作为分析物。机器会自动算出每个样品所需要的体积，然后按照指定位置放置好，设定程序，开始自动运行，用时7个小时左右（根据样本量），第二天就可以看到数据结果。
下面要介绍下做Biacore会用到的工具，有钱的同志可以尽情地买买买，买穷了算你老板的。芯片种类主要有这么几种：
CM5：羧基化的葡聚糖芯片，最常用的传感芯片
CM4：羧基化程度较CM5低，可适当减少非特异性吸附；
C1：不含葡聚糖的羧基表面，适用于小分子量的细胞、病毒及无需葡萄糖研究的应用；
SA：在羧基化的葡聚糖芯片表面覆盖了一层链酶生物素（streptavidin），适用于捕获生物素标记的配体（DNA、肽段、糖、蛋白质等）；
NTA：在羧基化的葡聚糖芯片表面覆盖了一层氨三乙酸（NTA），可通过金属螯合作用捕获末端带有组氨酸修饰（His-tag）的配体；
HPA：疏水表面，适用于单层脂质分子与膜蛋白的相互作用；
L1：在羧基化的葡聚糖芯片表面覆盖了一层亲脂物质，直接捕获脂质分子并保持其活性。
接着我们来看下Biacore大概流程，首先是芯片表面预处理（偶联）。
考虑到CM5为最常用芯片，第一回先用蛋白A偶联在CM5芯片上，芯片经活化处理后，就准备进样，进样我们需要考虑的因素有：
（1）预富集：预富集的目的在化学偶联过程，通过静电作用吸附并提高芯片表面附近的配体浓度，从而提高偶联的效率和减少配体消耗。
（2）配体偶联水平：根据公式，知道配体与分析物的分子量大小即可计算得出偶联量，配体浓度初次可尝试20ug/ml；
（3）偶联缓冲液选择：这里我们针对配体蛋白质的等电点，摸索缓冲液的pH。10mM,pH5.0醋酸钠对大多蛋白质都较为合适。
实验过程：将蛋白A（母液浓度为：）稀释至20ug/ml，偶联量为220RU ；逐渐降低浓度至2.5ug/ml时，偶联量达到200RU左右，此为接下来用到的工作浓度。进一步摸索分析物，此次分析物也是蛋白，优化缓冲Buffer和降低分析物浓度以及增加分析物流速依旧没能消除非特异性吸附，遂改用另一种方法。如果是验证蛋白和核酸，有专门的SA芯片，核酸作为配体先偶联在芯片上，这时蛋白就作为分析物。
方法二：避免浪费此次仍可旧延用上回的CM5芯片，配体为带有His-tag修饰的蛋白A（浓度13g/L），这里要注意的是我们要在CM5芯片表面认为的加上Anti-His抗体，这时在蛋白A流经芯片时通过抗原抗体结合原理就会偶联在芯片上，此次摸索浓度为2.5ug/ml，即达到偶联量200RU。摸索分析物浓度，发现此次没有非特异性吸附，终于能继续往下做了，意味着设置好分析物浓度就能不用独守仪器，任他自由发挥了，好期待。。。
分析物按照倍比稀释设置了浓度梯度（5uM,4uM,2uM,1uM,500nM(重复组), 250nM, 100nM, 50nM, 25 nM,10 nM,5 nM,2.5 nM,0）
机器会自动算出每个样品所需要的体积，然后按照指定位置放置好，设定程序，开始自动运行，用时7个小时左右（根据样本量），第二天就可以看到数据结果。
如果配体预富集不成功，会弹出此提示，后续的程序会自动终止。
这就是配体偶联成功并达到计算的偶联量，程序会自动进入后续分析，第二天就可以看到结果，此次成功的结果图是这样的。
注释：KD值为亲和力常数，ka为结合常数，kd为解离常数。
我挑两个最明显的曲线作解释：每个浓度的曲线都会有拟合曲线，理论上拟合曲线和原浓度结合曲线应该重合，现在看到分析物浓度越大重合度越不好，这和分析物buffer有关，分析物buffer与缓冲液成分有差别，浓度越大越明显，也就是溶液的容积效应越明显。下方的分析物浓度依次减低，拟合曲线是重合的很好的，为了图片好看，也可以删除几个高浓度的。另外，可以将数据拷出自行用软件作图。由于篇幅限制，今天就讲到这，最后放一张Excel处理后的结果图。
好了，今天就策到这里，希望大家不要一脸懵逼。
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