上一篇简单的介绍了Biacore 的基本原理及应用(利用 BIAcore 分析相互作用的蛋白质(上篇)——原理和应用, 点我查看哦),也许有同志会说,咱有钱,交给公司做吧,但实际情况是,公司的科研狗们看着这几个技术头也要疼死了,不一定做得结果来。Biacore 我们粗略的知道了它好用,但还是没有尝到甜头,今天分享一个实战的例子。
所谓磨刀不误砍柴工,在正式实验开始前我们往往都会摸索合适条件,条件到位了,但这个技术要注意两个问题:蛋白纯度和非特异性吸附。
首先,我们拿到两个纯度95%的蛋白后,要确定配体和分析物,如果两个都是蛋白,这个配体和分析物可以先随意固定一个。如果是验证蛋白和核酸,有专门的SA芯片,核酸作为配体先偶联在芯片上,这时蛋白就作为分析物。机器会自动算出每个样品所需要的体积,然后按照指定位置放置好,设定程序,开始自动运行,用时7个小时左右(根据样本量),第二天就可以看到数据结果。
下面要介绍下做Biacore会用到的工具,有钱的同志可以尽情地买买买,买穷了算你老板的。芯片种类主要有这么几种:
CM5:羧基化的葡聚糖芯片,最常用的传感芯片
CM4:羧基化程度较CM5低,可适当减少非特异性吸附;
C1:不含葡聚糖的羧基表面,适用于小分子量的细胞、病毒及无需葡萄糖研究的应用;
SA:在羧基化的葡聚糖芯片表面覆盖了一层链酶生物素(streptavidin),适用于捕获生物素标记的配体(DNA、肽段、糖、蛋白质等);
NTA:在羧基化的葡聚糖芯片表面覆盖了一层氨三乙酸(NTA),可通过金属螯合作用捕获末端带有组氨酸修饰(His-tag)的配体;
HPA:疏水表面,适用于单层脂质分子与膜蛋白的相互作用;
L1:在羧基化的葡聚糖芯片表面覆盖了一层亲脂物质,直接捕获脂质分子并保持其活性。
接着我们来看下Biacore大概流程,首先是芯片表面预处理(偶联)。
考虑到CM5为最常用芯片,第一回先用蛋白A偶联在CM5芯片上,芯片经活化处理后,就准备进样,进样我们需要考虑的因素有:
(1)预富集:预富集的目的在化学偶联过程,通过静电作用吸附并提高芯片表面附近的配体浓度,从而提高偶联的效率和减少配体消耗。
(2)配体偶联水平:根据公式,知道配体与分析物的分子量大小即可计算得出偶联量,配体浓度初次可尝试20ug/ml;
(3)偶联缓冲液选择:这里我们针对配体蛋白质的等电点,摸索缓冲液的pH。10mM,pH5.0醋酸钠对大多蛋白质都较为合适。
实验过程:将蛋白A(母液浓度为:)稀释至20ug/ml,偶联量为220RU ;逐渐降低浓度至2.5ug/ml时,偶联量达到200RU左右,此为接下来用到的工作浓度。进一步摸索分析物,此次分析物也是蛋白,优化缓冲Buffer和降低分析物浓度以及增加分析物流速依旧没能消除非特异性吸附,遂改用另一种方法。如果是验证蛋白和核酸,有专门的SA芯片,核酸作为配体先偶联在芯片上,这时蛋白就作为分析物。
方法二:避免浪费此次仍可旧延用上回的CM5芯片,配体为带有His-tag修饰的蛋白A(浓度13g/L),这里要注意的是我们要在CM5芯片表面认为的加上Anti-His抗体,这时在蛋白A流经芯片时通过抗原抗体结合原理就会偶联在芯片上,此次摸索浓度为2.5ug/ml,即达到偶联量200RU。摸索分析物浓度,发现此次没有非特异性吸附,终于能继续往下做了,意味着设置好分析物浓度就能不用独守仪器,任他自由发挥了,好期待。。。
分析物按照倍比稀释设置了浓度梯度(5uM,4uM,2uM,1uM,500nM(重复组), 250nM, 100nM, 50nM, 25 nM,10 nM,5 nM,2.5 nM,0)
机器会自动算出每个样品所需要的体积,然后按照指定位置放置好,设定程序,开始自动运行,用时7个小时左右(根据样本量),第二天就可以看到数据结果。
如果配体预富集不成功,会弹出此提示,后续的程序会自动终止。
这就是配体偶联成功并达到计算的偶联量,程序会自动进入后续分析,第二天就可以看到结果,此次成功的结果图是这样的。
注释:KD值为亲和力常数,ka为结合常数,kd为解离常数。
我挑两个最明显的曲线作解释:每个浓度的曲线都会有拟合曲线,理论上拟合曲线和原浓度结合曲线应该重合,现在看到分析物浓度越大重合度越不好,这和分析物buffer有关,分析物buffer与缓冲液成分有差别,浓度越大越明显,也就是溶液的容积效应越明显。下方的分析物浓度依次减低,拟合曲线是重合的很好的,为了图片好看,也可以删除几个高浓度的。另外,可以将数据拷出自行用软件作图。由于篇幅限制,今天就讲到这,最后放一张Excel处理后的结果图。
好了,今天就策到这里,希望大家不要一脸懵逼。
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