2019年2月21日一项刊登在国际杂志EMBO J上的研究报告中,来自葡萄牙和法国的科学家们通过研究发现了端粒调节的一个关键步骤。如今研究人员发现越来越多的人类综合征归因于端粒的功能障碍,其中一种人类疾病就是名为CST的蛋白复合体功能异常所致,CST主要负责维持端粒功能,该复合体发生缺失就会引发名为Coats Plus的端粒疾病,这种综合征具有遗传性,而且主要特点表现为机体胃肠系统、骨骼系统、大脑等系统功能异常。 讯 /生物谷BIOON/ --染色体顶端有一种称之为端粒(telomeres)的结构,端粒就好比是鞋带末端的塑料保护罩,其类似于一种保护帽,来预防遗传物质伸展并被“腐蚀”,当端粒无法有效发挥功能时,其就会导致遗传物质被完全“腐蚀”,并诱发癌症以及年龄相关的疾病。
端粒是真核染色体的保护性末端,通过常规DNA聚合酶的协同作用复制并通过端粒酶延长,但对该过程的调节尚不完全清楚。端粒复制需要(Ctc1 / Cdc13)-Stn1-Ten1,一种与RPA同源的端粒ss DNA结合复合物。在这里,我们表明,进化上保守的磷酸酶Ssu72负责终止裂殖酵母中的端粒复制循环。Ssu72控制STN1的端粒由在Ser74,位于其内保守的残基调节STN1磷酸招募OB倍域。因此,ssu72Δ突变体在端粒复制中是缺陷的并且表现出长的3'-ssDNA突出,表明有缺陷的滞后链DNA合成。我们还显示hSSU 72通过控制hSTN 1向端粒的募集来调节人细胞中的端粒酶活化。这些结果揭示了磷酸酶SSU 72 的先前未知但保守的作用,其中该酶通过激活滞后链DNA合成来控制端粒稳态,从而终止端粒复制的循环。
保守的(CTC 1)-Stn1-Ten1复合物调节DNA滞后链合成和端粒酶活性。CDK1依赖性磷酸化阻止Stn1与端粒结合,并被Ssu72磷酸酶逆转,从而允许端粒突出填充反应并因此抑制端粒酶。
全基因组筛选将Ssu72鉴定为裂殖酵母中端粒延伸的负调节物
通过控制Stn1-Polα相互作用,Ssu72是半保守DNA复制所必需的
Ssu72在位于OB折叠结构域的新的高度保守的磷酸化位点调节裂殖酵母中的Stn1磷酸化。
Ssu72磷酸酶在通过Stn1募集控制端粒延伸中的作用在人细胞中是保守的。
端粒是蛋白质-DNA复合物,其形成真核染色体的末端(在Palm&de Lange,2008中综述)。端粒的主要功能是防止遗传信息的丢失和抑制染色体末端的DNA修复,从而保持端粒保护和基因组稳定性。端粒调节的丧失与癌症的两个主要标志有关:复制不朽和基因组不稳定(Hanahan&Weinberg,2011)。然而,端粒面临另一个挑战:DNA复制。由于富含G的重复DNA序列和保护结构,端粒代表了通过复制叉的天然障碍(Maestroni 等,2017)),复制叉崩溃可能导致整个端粒束丢失。为了抵消这些影响,端粒酶(粟酒裂殖酵母中的 Trt1 和哺乳动物中的TERT)负责向端粒添加特定的重复序列,从而补偿细胞无法完全复制染色体末端(Greider&Blackburn,1985)。然而,目前尚不完全了解端粒酶活性是如何被调节的以及端粒酶循环如何与端粒DNA复制偶联。有趣的是,正确的端粒延伸需要几种DNA复制蛋白(Dahlen 等,2003)。相反,特定的端粒成分本身是正确的端粒复制和端粒长度调节所必需的(Miller等,2006 ; Sfeir 等,2009),提示通过端粒酶将端粒复制和端粒延伸分开的细线。
使用裂殖酵母,Chang 等(2013)提出了一个动态模型,该模型演示了端粒复制如何控制端粒长度以及端粒复合物如何进行。端粒dsDNA结合成分Taz1,Rap1和Poz1促进Polα-Primase向端粒的募集。由于较短的端粒具有较少的Taz1 / Rap1 / Poz1,Polα-Primase募集和滞后链合成被延迟,导致ssDNA在端粒处积累。该事件导致检查点激酶Rad3 ATR的激活以及随后的端粒Ccq1-T93的磷酸化,这是裂殖酵母中端粒酶活化所需的步骤。因此,由于延迟的Polα-Prima酶募集到短端粒和随后的ssDNA积累,Rad3 ATR被瞬时激活,导致端粒酶募集和端粒延长。
已知另一种称为CST(酿酒酵母中的 Cdc13 / Stn1 / Ten1 和哺乳动物中的CTC1 / STN1 / TEN1)的复合物控制端粒复制。该复合物负责5'-ssDNA链保护免于核溶解降解和Polα-引物复合物向端粒的募集,从而促进端粒滞后链DNA合成(Lin&Zakian,1996 ; Grossi 等,2004)。值得注意的是,CST不仅需要招募Polα-primase,还要负责从初选转换为聚合酶活性,这是无间隙DNA复制所必需的(Lue 等,2014)。在人类中,除了它在端粒复制中的作用外(Surovtseva 等,2009),CST复合物还通过引物没收和与POT1-TPP1二聚体的直接相互作用抑制端粒酶活性而起到端粒酶活性终止子的作用(Chen 等,2012)。然而,调节这些CST功能的机制仍然未知。在裂殖酵母中,尽管存在STN1和TEN1同源物,但迄今尚未鉴定出Cdc13 / CTC1同源物(Martín 等,2007)。最近的研究表明,STN1所需的端粒和subtelomeres的复制(滝川等人,2017 ; Matmati 等人,2018),支持在DNA复制裂殖酵母(C)的ST的保守作用。
与端粒长度调节的复制模型一致(Greider,2016),端粒结合蛋白Rif1通过将Glc7磷酸酶募集到复制起点并抑制芽殖酵母中的Cdc7活性来调节端粒DNA复制时间(Hiraga 等,2014 ; Mattarocci 等,2014)。值得注意的是,这种作用在其他生物中是保守的,例如裂殖酵母(Davé 等,2014)和人类细胞(Hiraga 等,2017)。重要的是,rif1 +突变体显示长端粒; 这种效应被认为是原因引发失调的结果(Greider,2016)。然而,端粒复制如何终止以及如何与端粒酶活性的调节相结合仍然未知。在这里,我们报告蛋白磷酸酶Ssu72显示作为端粒复制终止子的保守作用。Ssu72之前被鉴定为RNA聚合酶II C-末端结构域磷酸酶,并且从酵母到人高度保守(Krishnamurthy 等,2004)。此外,Ssu72通过抵抗内聚复合物亚基SA2的磷酸化而起到与姐妹染色单体凝聚相关的粘附素结合因子的作用(Kim 等,2010))。在裂殖酵母中,除了调节RNA聚合酶活性外,Ssu72还被证明可以调节染色体浓缩(Vanoosthuyse 等,2014)。然而,之前的研究均未发现端粒复制失调。我们的数据强烈支持Ssu72通过调节Stn1丝氨酸-74磷酸化来控制滞后链合成的意外作用,从而减少端粒ssDNA和抑制端粒酶募集。
蛋白质磷酸化在细胞生物学的几乎所有方面都起着关键的调节作用。尽管蛋白激酶在端粒生物学中的功能已被广泛研究,但磷酸酶的作用仍然大部分未被探索。与此趋势相反,芽殖酵母Pph22磷酸酶最近显示以细胞周期依赖性方式调节Cdc13的磷酸化(Shen 等,2014)。Pph22对特定Cdc13残基的去磷酸化逆转了Cdc13与Est1的相互作用,从而使端粒酶与端粒脱离(Shen 等,2014)。
然而,迄今为止,还没有已知的磷酸酶能够调节裂殖酵母或高等真核生物中的端粒长度。这里提供的数据描述了高度保守的磷酸酶在端粒调节中的前所未有的作用。Ssu72属于基于半胱氨酸的II类磷酸酶组,与低分子量磷酸酶和一些细菌砷酸盐还原酶同源(Alonso&Pulido,2016)。虽然最广为人知的是它在不同物种中作为RNA聚合酶II CTD磷酸酶的作用(Krishnamurthy 等,2004),但人类SSU72也被鉴定为可与肿瘤抑制因子视网膜母细胞瘤蛋白相互作用的蛋白质(St-Pierre 等,2005)并且可以靶向自身免疫性关节炎中的STAT3信号传导和Th17激活(Lee 等,2017)。已经在人细胞中报道了其他功能,包括cohesin SA2去磷酸化(Kim 等,2010)。与蛋白磷酸酶的多重作用一致,我们的工作证明Ssu72磷酸酶还通过控制Stn1的募集和促进Stn1-Pol1相互作用来调节rDNA和端粒复制,从而激活滞后链DNA合成。
目前,尚未充分了解滞后链DNA复制如何抑制端粒酶活性。在裂殖酵母中,Rad3激酶在DNA复制过程中通过ssDNA的产生而被激活,通过Thr93处的Ccq1磷酸化导致端粒酶募集(Moser 等,2012)。在该模型中,滞后链聚合酶的填充反应减少了端粒处的ssDNA,从而导致负反馈环。与端粒ssDNA在裂殖酵母中激活端粒酶的作用一致,ssu72Δ细胞具有更长的突出端,Ccq1的广泛磷酸化和端粒中更高水平的端粒酶。此外,Rad3和Ccq1-T93磷酸化都是ssu72Δ中端粒延长所必需的。突变体。因此,还需要Ssu72磷酸酶活性来调节Ccq1磷酸化。需要进一步的实验来检验这一假设。
我们的研究表明,Ser74的Stn1磷酸化是调节端粒长度所必需的。Stn1 Ser74突变为天冬氨酸(一种模拟组成型磷酸化的氨基酸)导致端粒延伸,其是ssu72Δ突变的上位性。该结果表明Ser74磷酸化足以解释Ssu72对端粒长度的调节。在我们的质谱分析中鉴定的磷酸化位点位于Stn1的OB-折叠结构域内。已知OB-折叠磷酸化调节蛋白质-DNA结合和蛋白质 - 蛋白质相互作用。例如,OB-fold结构域中人TPP1(Tpz1直向同源物)的磷酸化调节端粒酶-TPP1相互作用(Zhang 等,2013))。在裂殖酵母中,我们的数据表明Ser74的Stn1磷酸化可能阻止其在早期S期与端粒DNA的结合。此外,我们的数据显示cdc2 CDK1活性抑制ssu72Δ背景中端粒的Stn1募集。此外,并且相对于其他细胞周期激酶如HSK1 CDC7和plo1 PLK,端粒伸长ssu72 Δ的突变体被反转以增加的失活CDC2-M68温度敏感等位基因。有趣的是,Ssu72 在滞后链合成聚合酶的同时被招募到S / G 2期的端粒(Moser 等,2009b)。虽然需要进一步的实验,但有吸引力的模型涉及Stn1的Cdc2 CDK1磷酸化,因此在滞后链合成中产生延迟并允许端粒延长。然而,我们不能排除通过ssu72Δ突变体中的Cdc2失活实现的端粒Stn1募集的拯救是间接的,可能通过细胞周期依赖性事件起作用。此外,Ssu72磷酸酶通过促进Stn1与DNA聚合酶α的结合来逆转这一过程(图 4E)。值得注意的是,Stn1的去磷酸化必须与Tpz1 SUMOylation协调,这对于将Stn1募集到端粒是至关重要的。因此,去磷酸化和SUMO化介导的与Tpz1的相互作用均控制端粒Stn1-Ten1的募集和活性。
SSU72磷酸酶似乎在整个进化过程中是保守的。HT1080细胞系中人SSU72同源物的消耗导致与裂殖酵母ssu72Δ突变体中观察到的相似的表型。首先,HT1080细胞中的SSU72下调触发端粒处的DNA损伤信号传导。其次,SSU72耗尽导致端粒酶依赖性端粒延长。第三,在SSU72耗尽的HT1080细胞中,STN1向端粒的募集是有缺陷的。一致地,我们观察到SSU72耗尽细胞中端粒脆性增加(MTS),在STN1缺陷细胞中也观察到表型(Chen 等,2012))。我们建议SSU72以类似于裂殖酵母的方式调节人端粒的STN1募集。目前,没有证据表明人类细胞中存在STN1磷酸化。然而,Ser74在人类中是一种能够被磷酸化的氨基酸(Thr81)。进一步分析将确定人STN1是否在该残基处被磷酸化以及该修饰是否调节人端粒复制。
最近,提出了一种模型,其中复制叉调节端粒酶活性(Greider,2016)。该模型描述了原始发射和复制叉通过的调节如何影响端粒稳态。此外,我们建议端粒复制由两组磷酸酶控制。一方面,端粒复制的发生受Rif1-PP1A磷酸酶的调节,通过抑制亚端粒复制起点的DDK活性。另一方面,我们现在显示端粒滞后链合成受Ssu72磷酸酶调节,其促进Stn1-聚合酶α相互作用,从而终止端粒复制并导致端粒酶抑制。
在这项研究中,研究人员揭示了CST复合体中S组分的调节机制,他们发现,与S组分相关的STN1蛋白能被一种化学修饰所调节,而这种化学修饰会导致蛋白质中磷的插入,此外,其还会被一种名为磷酸酶SSU72的酶类所逆转,以这种方式,STN1蛋白就能促进端粒复制和端粒酶的调节,端粒酶是一种能够延长端粒的特殊酶类。
研究者指出,上述过程在酵母和人类细胞中是一样的,这就意味着,S组分的调节会在历代进化过程中处于保守状态,这在某种程度上也揭示了该过程对维持细胞功能的重要性,同时也有望帮助研究人员开发治疗端粒缺失相关疾病的新型疗法。
最后研究者Jose Escandell说道,这种进化保守磷酸酶的关键角色会让我们想起抵消激酶作用的磷酸酶对细胞周期的调节作用,从而会重建细胞周期过程的基本状态,后期研究人员将会通过更为深入的研究来阐明端粒调节的分子机制,这对于理解人类癌症和老化发生的原因至关重要。人类距离永葆青春的愿望越来越近了!
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