撰文丨梁家琦 靳学
随着快递的推广应用，我们日常生活中的货物递送变得异常方便。有趣的是，科学家们发现，在细胞的世界里也有属于他们的“快递”，叫细胞外囊泡（Extracellular Vesicles，EVs）。EVs是一种脂质双分子膜包裹的小囊泡，就好像是细胞间进行远程通讯的一种快车 (Express Vehicle)。1983年科学家首次在绵羊网织红细胞中发现EVs，当时多数人认为它是细胞排出废物的一种方式。然而，2007年，瑞典哥德堡大学的Lötvall实验室的研究则颠覆了以往的认知。研究者在小鼠和人肥大细胞系（MC/9和HMC-1），以及原代小鼠肥大细胞产生的外泌体中发现mRNA和microRNA，并且携带的RNA可以被递送至新细胞中发挥功能，实现细胞间的遗传信息交换[1]，这一里程碑式的发现使EVs领域变得活跃起来。
（细胞外囊泡示意图[2]。Exosome（外泌体）：由内体分泌到细胞外，大小为30-200 nm的囊泡；microvesicles（微泡）：由细胞膜分泌，大小为200-1000 nm的囊泡）
近期的研究发现，EVs中可以携带蛋白质、核酸、脂类分子等生物活性成分，它可以将分子货物转移到受体细胞实现细胞间通讯，或用于排出代谢物废物。EVs在细胞间通讯中起到关键的信使作用，阐明EVs在疾病发生的机制中的作用，对于疾病的液体活检和治疗都具有重要的意义。清华大学药学院尹航教授课题组最近的研究表明，天然免疫中Toll样受体9（TLR9）配体寡聚核苷酸（ODN）刺激巨噬细胞所分泌的EVs能够转移至受体细胞，扩大TLR9信号的激活；同时激活受体细胞中的Cdc42蛋白，以此增强受体细胞摄取EVs的能力。这项发表在Science Advances杂志上的工作首次揭示了免疫细胞在Toll样受体激活条件下传递免疫免疫信号的分子机制，填补了EVs摄取过程中分子调节机制的空白。
Toll样受体（toll-like receptors, TLRs）是天然免疫中一类非常重要的模式识别受体，负责识别病原相关分子模式（pathogen-associated molecular patterns, PAMPs）以及损伤相关分子模式（danger-associated molecular patterns, DAMPs），从而激活下游的免疫反应。TLRs通路的紊乱或失调会引起机体产生各类炎症反应或自身免疫性疾病，如系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎等。
已知在单个细胞水平上，单链核酸ODN可以激活TLR9，然而这种免疫激活是否能在细胞间传递却尚不可知。为了研究TLR9免疫刺激的转移，研究者利用了表达 Cre基因的蓝细胞系（表达青色蛋白），以及表达LoxP基因的红细胞系（表达红色蛋白）组成的Cre-LoxP重组系统。蓝细胞系在Transwell细胞培养系统中培养，该系统分为上下两层，中间由直径为400 nm的滤膜分隔开，滤膜可阻止蓝细胞系迁移但允许EVs游离至红细胞系的环境中。当红细胞摄入了分泌自蓝细胞含Cre-mRNA的EVs后，Cre重组酶会诱导产生Cre-LoxP重组，导致红细胞表达红色荧光的基因被切除，并开始表达绿色荧光的基因。
（Cre-LoxP重组系统示意图）
报道中应用荧光共聚焦成像、荧光超分辨成像等技术手段，观察荧细胞摄取EVs的情况。首先证明了ODN刺激供体细胞释放的EVs中包含ODN，而携带ODN的EV在被受体细胞摄取后，会与受体细胞的TLR9作用，由此说明了细胞在受到ODN刺激后，能通过EVs传递ODN到受体细胞，并结合受体细胞的TLR9。另一方面，研究者发现ODN的刺激供体细胞产生的EVs能够更容易地被受体细胞摄取。
（超分辨显微成像观察细胞对EVs的摄入情况。青色：Cre-CFP细胞；绿色：GFP报告细胞；红色：LoxP-DsRed-LoxP-GFP细胞）
EVs介导细胞间天然免疫的原动力是什么？
为了探寻ODN增强受体细胞摄取EVs能力的分子机制，研究者针对对照组EVs （CTRL-EV）与免疫刺激后产生的EVs （ODN-EV）进行了蛋白质组学的分析，最终锁定了Cdc42蛋白。Cdc42蛋白为细胞分裂周期蛋白，属于Rho家族的小G蛋白，调控多种细胞功能相关的信号通路。通过对cdc42的基因沉默以及蛋白的过表达实验，研究者确认了EVs中携带活化的Cdc42蛋白，并能够刺激受体细胞中Cdc42蛋白的表达与活化，以此增强受体细胞摄取EVs的能力。最后，研究者通过酶联免疫吸附测定以及荧光共聚焦成像等手段，证明了ODN-EV能够刺激受体细胞释放炎症因子TNF-α，进一步激活受体细胞中的Cdc42蛋白，从而阐述了ODN刺激供体细胞，并将炎症信号传递至受体细胞的分子机制。阐述的整体机制如下图所示：
（细胞外囊泡介导巨噬细胞间TLR9信号传导机制示意图。蓝色：Cre-CFP细胞，红色：LoxP-DsRed-LoxP-GFP细胞，箭头表示囊泡和生物大分子运动方向）
尹航教授为国际细胞外囊泡协会（International Society of Extracellular Vesicles, ISEV）理事及学术部委员，长期从事细胞外囊泡相关工作。此次针对细胞通过摄取EVs调节TLR9通路信号传递的分子机制研究，促进了我们理解EVs调节TLRs在细胞内天然免疫应答中的作用。这项研究结果也有助于针对Cdc42蛋白调节EVs的摄取，进行相关炎症疾病和自身免疫疾病的靶向疗法研究。
EVs领域专家针对此项工作作出了评价。中国研究型医院学会副会长、中国细胞外囊泡研究与应用学术委员会主任委员、南方医科大学珠江医院院长王前教授评价说：“这项细胞外囊泡领域创新研究工作，为细胞间天然免疫信号转导机制的阐释指明了新方向，并且为进一步开发针对免疫疾病诊疗新方案提供了思路。” 国际外泌体协会学术部主任、美国约翰霍普金斯大学医学院Kenneth W. Witwer教授评价该工作时称：“来自清华大学尹航教授课题组的张莹及同事在发表在Science Advances杂志上的最新研究中，报道了关于早期预警系统如何感知到感染信号这一重要现象。这项工作今后可能对机体感染相关的疾病治疗研究有重要启示，并为细胞外囊泡通讯的特定分子机制研究奠定了基础。”
本文第一作者为清华大学药学院助理研究员张莹，通讯作者为清华大学药学院尹航教授。
尹航教授课题组简介
尹航，清华大学药学院全职教授、副院长，药学技术中心主任，中药研究院院长，生命科学联合中心高级研究员，结构生物学高精尖创新中心研究员。研究涉及化学生物学、免疫药物研发、蛋白质设计和计算机模拟、癌症筛查和诊断、自身免疫疾病等领域。
原始论文：
DOI: 10.1126/sciadv.aav1564
参考链接：
[1] Valadi, H., Ekström, K., Bossios, A., Sjöstrand, M., Lee, J.J., and Lötvall, J.O. (2007). Exosome-mediated transfer of mRNAs and microRNAs is a novel mechanism of genetic exchange between cells. Nature Cell Biology 9, 654.
[2] van Niel, G., D'Angelo, G., and Raposo, G. (2018). Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles. Nature Reviews Molecular Cell Biology 19, 213.
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