一种用于治疗类风湿关节炎的配伍组合物及其制备方法

专利名称：一种用于治疗类风湿关节炎的配伍组合物及其制备方法
技术领域：
本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种用于治疗类风湿关节炎的配伍组合物及其制备方法。

背景技术：
类风湿关节炎为一主要累及关节的全身性系统性风湿病。在人群各种族中均有较高的发病率和严重的致残率，对人类有极大的危害性。
卫矛科(Celastraceae)雷公藤属(Tripterygium)植物在我国有四种，分别为雷公藤(Tripterygium wilfordiiHook.F.)、昆明山海棠(T.hypoglaucum(Levl.Hutch)、黑蔓(东北雷公藤，T.regelii Sprague et Takeda)和苍山雷公藤(T.forretii Dicls)。另外，国外文献中报道有变种雷公藤(T.wilfordii var.regrlii)。雷公藤最早收载于《(神农本草经》，味苦，辛凉，有大毒，气味特异，其药用部位主要为根及根茎，民间用于治疗关节炎、跌打损伤、皮肤病、杀虫等。目前，已经有雷公藤片、雷公藤多苷片、雷公藤总萜片、雷公藤内酯软膏、昆明山海棠片、雷公藤双层片等多种制剂，可用于治疗类风湿关节炎。
雷公藤属植物化学成分复杂，至今已发现的成分约有200多种，分为生物碱、二萜、三萜、倍半萜等，已经从雷公藤属植物中分离出三十多种生物碱、五十多种二萜类成分、五十多种三萜类成分、四十多种倍半萜类成分，二萜类为其主要活性成分，三萜类和生物碱也是活性成分。雷公藤属植物化学成分包括二萜类如雷公藤内酯酮(triptophenide)、雷公藤内酯醇(triptolide)、雷公藤乙素(tripdiolide)、雷公藤丙素(triperolide)、雷醇内酯(triptolidenol)、16-羟基雷公藤内酯醇(16-hydroxytriptolide)、雷藤内酯四醇(triptetraolide)、雷藤内酯三醇(triptriolide)、雷藤氯内酯(tripchlorolide)、12-表雷藤内酯三醇(12-epitriptriolide)、异雷公藤内酯四醇(isotriptetraolide)、13，14-epoxide 9，11，12-trihydroxytriptolide、新雷公藤内酯四醇(neotriptetraolide)、雷公藤内酯二醇酮(tripdioltonide)、雷酚内酯(triptophenolide)、雷酚内酯甲醚(triptophenolide methyl ether)、雷酚酮内酯(triptonolide)、雷酚新内酯(neotriptophenolide)、异雷酚新内酯(isoneotriptophenolide)、雷酚萜(triptonoterpene)、雷酚萜甲醚(triptonoterpene methylether)、neatripeonoterpent、雷酚萜醇(triptonterpenol)、11-hydroxy-14-methoxyldehydroabietane、雷藤二萜酸(triptoditerpenic acid)、山海棠酸(hypogtic acid)、雷酚二萜酸(triptonoditerpenic acid)、wilforol E、F、tripfinin B、triptoquinone(A、B、C、D、E、F、G)、triptobenzene(A、B、C、D、E、F、G、J、K)、雷公藤苯L、M、N(triptobenzene L、M、N)、异雷酚内酯(isotriptophenolide)、雷藤素(wilforonide)、山海棠二萜内酯A(hypodiofide A)、16-hydroxy-19，20-epoxy-kaurane A等；生物碱如雷公藤定碱(Wilfordine)、雷公藤次碱(Wilforine)、雷公藤吉碱(wilforgine)、雷公藤春碱(wilfortrine)、雷公藤碱庚(wilforine)、雷公藤碱戊(wilforidine)、雷公藤碱己(wilformine)、雷公藤宁碱(wilfornine)、雷公藤精碱(wilforjine)、1-desacetylwilfordlne、1-desacetyl wilfortrlne、2-debenzoyl-2-nicotinoylwilforine、雷公藤碱辛(neowilforine)、triptonine A、triptonine B、雷公藤碱壬(neowilforzine)、peritass-ines A、异雷公藤春碱(isowilfortrine)、雷公藤明碱(wilford-sine)、雷公藤榕碱(wilfordlongine)、卫矛碱(euonymine)、异雷公藤定碱(isowilfordine)、雷公藤定宁D、E、F、G、H(wilfordinineD、E、F、G、H)、苯乙烯南蛇碱(celacinnine)、呋喃南蛇碱(celafurine)、苯代南蛇碱(celabenzine)、南蛇藤别肉桂酰胺碱(celallocinnine)、黑蔓酯碱(regefidine)、雷公藤植碱(wilfordsuine)、雷公藤康碱(wilfordconine)等；三萜类如雷公藤红素(tripterine)、扁朔藤素(printimerin)、3，24-二氧代木栓烷-29-羟酸(3，24-dioxofridelan-29-oic)、polpunonic acid、2-hydroxy-polpunonic acid、wilforol A、demethyl-zeylasteral、demethylzeylastemne、23-nor-6-oxo-demethyl-zeylastemne、3-hydroxy-2-oxo-3-fridelen-20α-carboxylic acid、tripterygone、2，3-dihydroxy-friedelΔ1，3，5，(10)，7-6-actone-29-oic acid、orthosphenic acid、萨拉子酸(salasponnic acid)、triptotin C、wilforol B(2，3-dihydroxy-friedel-6，9(11)-en-29-oicacid)、wilforolD、3β，29-dihydroxy-DB-friedolean-5-en、Congomnine、卡漆-5-烯-3β，28-二醇(glut-5-en-3β，28-diol)、雷公藤内酯甲、乙(wilfortide A、B)、山海棠内酯(hypoglaulide)、黑蔓内酯(regelide)、雷藤三萜酸A、B、C(triptotriterpenic acid A、B、C)、3-epikatonic acid、雷二羟酸甲酯(triptodihydroxy acid methyl ether)、黑蔓酮酯甲、乙、丙、丁(regelin I、II、III、D)、黑蔓醇酯甲、乙(regelindiol A、B)、demethylregelinn、oleana-9(11)，12-dien-3-one、齐墩果酸乙酸酯(3-acetoxyoleanolic acid)、山海棠萜酸(hypoglauterpenicacid)、tripterygic acid A、齐墩果酸乙酸酯(3-alhoxyoleanolic alid)、山海棠萜酸(hypogxauserponicalid)、tripterygic alid A、齐墩果酸(oleanohc acid)、3-oxo-22α-hydroxy-Δ12-OleaHen-29-oic acid、3β，2α-二羟基-Δ12-齐墩果烯-29-羟酸(3β，2α-dihydroxy-Δ12-oleanen-29-oic acid)、3-acetyl-oleanolic acid、wifoml C、3α，24-di-hydroxy-olean-12-en-28-oic acid、2α，，3α，24-trihydroxy-Δ12-ursene-28-oic acid、3β，15β-dihydroxy-Δ12-oleanen-28-oic acid、3β-hydroxy-olean-11，13(18)-diene、乌索-3β，5α-二醇(ursan-3β，5α-diol)、triptotriterpenoidal lactone A、zeorin、triptolactone、萨拉子酸-3-乙基醚(salaspormicacid-3-ethyfic aether)等。
雷公藤对各种动物毒性不同，它对人、犬、猪及昆虫的毒性很大，可以发生中毒甚至死亡，但是对羊、兔、猫、鼠、鱼却无毒性。雷公藤对机体的作用有二一为对胃肠道局部的刺激作用；二为吸收后对中枢神经系统(包括视丘、中脑、延髓、小脑及脊髓)的损害，及引起肝、心的出血与坏死。雷公藤主要毒害动物的心脏，对其他平滑肌及横纹肌亦有毒性，引起中毒致死。中毒后采用催吐、洗胃、灌肠、导泻等一般急救措施解毒。雷公藤属植物制剂在治疗中也容易出现毒副作用，如引起患者血液白细胞或红细胞下降，引起恶心、胃痛、腹泻，引起肝功能损害，能明显加重老年人肾功能不全，引起生殖系统不良反应(女性月经不调，男性精子活力减弱、数量减少)，还可能出现红斑、引起脱发，听力减退，手足小关节痛等。
芍药属植物约35种，分布于欧、亚大陆温带地区，根据其生长习性和花盘形状分为两组，一是牡丹组，二是芍药组。芍药组植物约30种，主要分布在欧、亚大陆温带地区，有二种产于美洲。国外产的芍药组植物，都是花卉的重要种；我国产的芍药组植物有八种和六个变种，八种芍药分别是草芍药、美丽芍药、芍药、多花芍药、白花芍药、川赤药、新疆芍药和窄叶芍药。芍药组植物大都含芍药苷，根中含量1.8～7.3％，叶中含量1％左右，另含芍药内酯苷、苯甲酰芍药苷、芍药新苷等苷类成分以及挥发油、脂肪油、树脂、鞣质、糖、淀粉、粘液质、蛋白质等。
《天津中医药》2005年6月第22卷第3期发表一篇白芍总苷联合雷公藤多苷治疗类风湿关节炎的论文，该论文的结论指出白芍总苷和雷公藤多苷联合使用不但提高了治疗RA的疗效，并且降低了单一使用雷公藤对肝脏的损害，但其疗效还不尽人意，而且对肝脏还存在一定程度的损害。


发明内容
本发明的目的是提供一种用于治疗类风湿关节炎的雷公藤和芍药配伍组合物及其制备方法。
上述的目的通过以下的技术方案实现 一种雷公藤与芍药的配伍组合物，由雷公藤和芍药配伍成药方，所述的雷公藤与芍药的配伍其重量份比为雷公藤∶芍药＝0.01～100∶1的比例。
所述的雷公藤是指卫矛科雷公藤属植物、雷公藤属植物提取物、雷公藤属植物加工成的药材和炮制品以及雷公藤属植物中含有的单一活性成分。卫矛科雷公藤属植物包括雷公藤、昆明山海棠、黑蔓(东北雷公藤)和苍山雷公藤、变种雷公藤。雷公藤活性成分包括包括雷公藤内酯酮、雷公藤内酯醇、雷公藤乙素、雷公藤丙素、雷醇内酯、16-羟基雷公藤内酯醇、雷藤内酯四醇、雷藤内酯三醇、雷藤氯内酯、12-表雷藤内酯三醇、异雷公藤内酯四醇、13，14-epoxide 9，11，12-trihydroxytriptolide、新雷公藤内酯四醇、雷公藤内酯二醇酮、雷酚内酯、雷酚内酯甲醚、雷酚酮内酯、雷酚新内酯、异雷酚新内酯、雷酚萜、雷酚萜甲醚、neatripeonoterpent、雷酚萜醇、11-hydroxy-14-methoxyldehydroabietane、雷藤二萜酸、山海棠酸、雷酚二萜酸、wilforol E、F、tripfinin B、triptoquinone(A、B、C、D、E、F、G)、triptobenzene(A、B、C、D、E、F、G、J、K)、雷公藤苯L、M、N、异雷酚内酯、雷藤素、山海棠二萜内酯A、16-hydroxy-19，20-epoxy-kaurane A、雷公藤定碱、雷公藤次碱、雷公藤吉碱、雷公藤春碱、雷公藤碱庚、雷公藤碱戊、雷公藤碱己、雷公藤宁碱、雷公藤精碱、1-desacetyl wilfordlne、1-desacetyl wilfortrlne、2-debenzoyl-2-nicotinoylwilforine、雷公藤碱辛、triptonine A、triptonine B、雷公藤碱壬、peritass-inesA、异雷公藤春碱、雷公藤明碱、雷公藤榕碱、卫矛碱、异雷公藤定碱、雷公藤定宁D、E、F、G、H、苯乙烯南蛇碱、呋喃南蛇碱、苯代南蛇碱、南蛇藤别肉桂酰胺碱、黑蔓酯碱、雷公藤植碱、雷公藤康碱、雷公藤红素、扁朔藤素、3，24-二氧代木栓烷-29-羟酸、polpunonic acid、2-hydroxy-polpunonic acid、wilforol A、demethyl-zeylasteral、demethylzeylastemne、23-nor-6-oxo-demethyl-zeylastemne、3-hydroxy-2-oxo-3-fridelen-20α-carboxylic acid、tripterygone、2，3-dihydroxy-friedel Δ1，3，5，(10)，7-6-actone-29-oic acid、orthosphenic acid、萨拉子酸、triptotin C、wilforol B、wilforol D、3β，29-dihydroxy-DB-friedolean-5-en、Congomnine、卡漆-5-烯-3β，28-二醇、雷公藤内酯甲、乙(wilfortide A、B)、山海棠内酯(hypoglaulide)、黑蔓内酯(regelide)、雷藤三萜酸A、B、C(triptotriterpenic acid A、B、C)、3-epikatonic acid、雷二羟酸甲酯(triptodihydroxy acidmethyl ether)、黑蔓酮酯甲、乙、丙、丁、黑蔓醇酯甲、乙(regelindiol A、B)、demethylregelinn、oleana-9(11)，12-dien-3-one、齐墩果酸乙酸酯、山海棠萜酸、tripterygicacid A、齐墩果酸乙酸酯、山海棠萜酸、tripterygic alidA、齐墩果酸、3-oxo-22α-hydroxy-Δ12-OleaHen-29-oicacid、3β，2α-二羟基-Δ12-齐墩果烯-29-羟酸(3β，2α-dihydroxy-Δ12-oleanen-29-oic acid)、3-acetyl-oleanolic acid、wifoml C、3α，24-di-hydroxy-olean-12-en-28-oic acid、2α，，3α，24-trihydroxy-Δ12-ursene-28-oic acid、3β，15β-dihydroxy-Δ12-oleanen-28-oic acid、3β-hydroxy-olean-11，13(18)-diene、乌索-3β，5α-二醇、triptotriterpenoidal lactone A、zeorin、triptolactone、萨拉子酸-3-乙基醚。
所述的芍药指毛茛科芍药属芍药组植物、芍药属芍药组植物提取物、芍药属芍药组植物加工而成的药材和炮制品以及芍药苷、芍药内酯苷、苯甲酰芍药苷、芍药新苷、羟基芍药苷、芍药花苷。芍药组植物包括草芍药、美丽芍药、芍药、多花芍药、白花芍药、川赤药、新疆芍药和窄叶芍药及其变种。
上述雷公藤与芍药的配伍组合物，是雷公藤属植物、雷公藤属植物提取物、雷公藤属植物加工成的药材和炮制品以及雷公藤属植物中含有的单一活性成分任意一种，与芍药属芍药组植物、芍药属芍药组植物提取物、芍药属芍药组植物加工而成的药材和炮制品以及芍药苷、芍药内酯苷、苯甲酰芍药苷、芍药新苷、羟基芍药苷、芍药花苷任意一种配伍组成组合物。
依照上述雷公藤与芍药的配伍组合物，可将本发明配伍组合物制成片剂或胶囊剂或栓剂或颗粒剂或口服液或糖浆或合剂或口服混悬液或丸剂或酊剂或膜剂或散剂或乳膏剂或注射剂或与其他药物复方制剂。
这个技术方案有以下有益效果 1.本发明雷公藤与芍药的配伍组合物，治疗类风湿关节炎效果不仅好于雷公藤制剂单用效果，而且好于白芍总苷联合雷公藤多苷治疗类风湿关节炎的效果，同时可以大大减轻或避免雷公藤制剂单用引起的毒副作用。
2.本发明可以制成药剂学上的各种制剂，如片剂、胶囊剂、栓剂、颗粒剂、口服液、糖浆、合剂、口服混悬液、丸剂、酊剂、膜剂、散剂、乳膏剂、注射剂等，并且可以和其他药物复方制剂。



图1，本发明组合物对大鼠佐剂性关节炎足爪肿胀度的影响(容积测量)图 图2，本发明组合物对大鼠佐剂性关节炎关节指数的影响图 图3，本发明组合物对LPS诱导腹腔巨噬细胞IL-1βmRNA表达的抑制作用图 图4，本发明组合物对LPS诱导腹腔巨噬细胞TNF-αmRNA表达的抑制作用图 1、对照组，2、模型组，3、组合物组，4、强的松组
具体实施例方式 实施例1 取雷公藤干品10g，赤芍药10g，粉碎成粗粉，加入95％乙醇渗漉，渗漉液回收乙醇，得雷公藤芍药配伍组合物。
实施例2 取雷公藤干品10g，炒白芍药100g，粉碎成粗粉，加入70％乙醇加热提取，重复提取提取三次，提取液回收乙醇，即得雷公藤芍药配伍组合物。
实施例3 取雷公藤干品2g，赤芍药100g，粉碎成粗粉，加入甲醇加热提取，重复提取提取三次，提取液回收甲醇，即得雷公藤芍药配伍组合物。
实施例4 取昆明山海棠干品100g，草芍药干品10g，粉碎成粗粉，加入丙醇加热提取，重复提取三次，提取液回收丙醇，即得雷公藤芍药配伍组合物。
实施例5 取黑蔓(东北雷公藤)干品100g，多花芍药干品2g，粉碎成粗粉，加入异丙醇加热提取，重复2次，提取液回收异丙醇，即得雷公藤芍药配伍组合物。
实施例6 取雷公藤干品50g，川赤芍90g，粉碎成粗粉，加入纯化水提取，合并提取液，浓缩，减压干燥，即得雷公藤芍药配伍组合物。
实施例7 取苍山雷公藤干品100g，白花芍药干品30g，粉碎成粗粉，加入纯化水加热提取，提取液浓缩成每m l约相当于生药1g，加入醋酸乙酯萃取，合并醋酸乙酯萃取液，回收醋酸乙酯，即得雷公藤芍药配伍组合物。
实施例8 取变种雷公藤干品20g，美丽芍药干品150g，粉碎成粗粉，加入纯化水加热提取，提取液浓缩成每ml约相当于生药1g，加入正丁醇醋酸乙酯(1∶1)混合萃取剂，合并正丁醇醋酸乙酯混合萃取液，加热回收正丁醇醋酸乙酯混合溶剂，即得雷公藤芍药配伍组合物。
实施例9 取雷公藤干品20g，赤芍药10g，粉碎成粗粉，加入95％乙醇渗漉，渗漉液回收乙醇，得雷公藤芍药乙醇提取浸膏；乙醇提取浸膏中加入醋酸乙酯提取，提取液回收醋酸乙酯，即得雷公藤芍药配伍组合物。
实施例10 取雷公藤干品50g，炒白芍药100g，粉碎成粗粉，加入70％乙醇加热提取，重复提取提取三次，提取液回收乙醇，得到雷公藤芍药乙醇提取浸膏；乙醇提取浸膏中加入醋酸乙酯提取，提取液回收醋酸乙酯，即得雷公藤芍药配伍组合物。
实施例11 取雷公藤干品1g，赤芍药90g，粉碎成粗粉，加入甲醇加热提取，重复提取提取三次，提取液回收甲醇，得到雷公藤芍药甲醇提取浸膏；甲醇提取浸膏中加入醋酸乙酯提取，提取液回收醋酸乙酯，即得雷公藤芍药配伍组合物。
实施例12 取昆明山海棠干品110g，草芍药干品15g，粉碎成粗粉，加入丙醇加热提取，重复提取三次，提取液回收丙醇，得到雷公藤芍药丙醇提取浸膏；丙醇提取浸膏加入醋酸乙酯提取，提取液回收醋酸乙酯，即得雷公藤芍药配伍组合物。
实施例13 取黑蔓(东北雷公藤)干品100g，多花芍药干品2g，粉碎成粗粉，加入异丙醇加热提取，重复2次，提取液回收异丙醇，得到雷公藤芍药异丙醇提取浸膏；异丙醇提取浸膏加入醋酸乙酯提取，提取液回收醋酸乙酯，即得雷公藤芍药配伍组合物。
实施例14 取苍山雷公藤干品100g，白花芍药干品30g，粉碎成粗粉，加入纯化水加热提取，提取液浓缩成每ml约相当于生药1g，加入醋酸乙酯萃取，合并醋酸乙酯萃取液，回收醋酸乙酯，即得雷公藤芍药配伍组合物。
实施例15 取变种雷公藤干品20g，美丽芍药干品150g，粉碎成粗粉，加入纯化水加热提取，提取液浓缩成每ml约相当于生药1g，加入正丁醇醋酸乙酯(1∶1)混合萃取剂，合并正丁醇醋酸乙酯混合萃取液，加热回收正丁醇醋酸乙酯混合溶剂，即得雷公藤芍药配伍组合物。
实施例16 取雷公藤干品50g，草赤芍200g，加入纯化水加热提取，合并提取液，放凉后上HPD-500大孔树脂柱，先用水洗去杂质，再用乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，回收乙醇，干燥，即得雷公藤芍药配伍组合物。
实施例17 取雷公藤干品1000g，加入甲醇回流提取，合并甲醇提取液，回收甲醇得甲醇提取浸膏；甲醇醇提取浸膏加入醋酸乙酯提取，合并醋酸乙酯提取液，回收醋酸乙酯得雷公藤提取物。
取赤芍药饮片9000g，加入70％乙醇回流提取，回收乙醇得乙醇提取浸膏；乙醇提取浸膏加入醋酸乙酯提取，回收醋酸乙酯得到赤芍药提取物。
将上述制备而得的雷公藤提取物与赤芍药提取物充分混合均匀，即得雷公藤芍药配伍组合物。
本发明雷公藤芍药配伍组合物对大鼠佐剂性关节炎的药效试验。
以下试验中所用的雷公藤和芍药配伍组合物为实施例17中制备而得的雷公藤芍药配伍组合物。
1、目的雷公藤和芍药配伍组合物对大鼠佐剂性关节炎的药效。
2、动物SD大鼠体重180+20g，雄性 3.方法 3.1实验分组SD大鼠，随机分为4组，即正常组、模型组、雷公藤和芍药配伍组合物组和阳性对照药强的组。每组12只。
3.2AA模型诱导大鼠足爪皮内注射福氏佐剂(CFA)0.1ml，同时设生理盐水对照组。炎症出现后用药，用药10天。CFA的配制方法将10mg卡介苗加入1ml石蜡油中，充分混匀后置4℃冰箱中过夜，注射前再进行充分混匀。
3.3给药时间及用药方法诱导后，每天观察足爪肿胀，足爪评分，足爪出现红肿，开始用药。灌胃给药，每天一次，用药12天。d28，处死大鼠，观察药效指标。
3.4检测指标 (1)足爪肿胀度的测定用足爪容积测量仪于致炎前，致炎后d12、d16、d20、d24、d28定期检测大鼠足爪肿胀度。
(2)全身病变体重变化，前肢、耳和尾部病变的发生率和严重度。
(3)关节指数按0-4五级评分，0＝无红肿；1＝小趾关节稍肿；2＝趾关节和足跖肿胀；3＝踝关节以下的足爪肿胀；4＝包括踝关节在内的全部足爪肿胀。
(4)疼痛指数用压痛仪测定每只大鼠的机械痛阈。先使用一定力度刺激，若没有缩腿反应，则选择其上一个力度刺激后趾，若有缩腿反应，则选择其下一个力度刺激后趾，即出现一次与前一次不同反应(有缩腿反应至无缩腿反应或无缩腿反应至有缩反应)时，即可记录该力度作为机械痛阈(超过25g的记为“无”压痛)。
(5)胸腺指数、脾指数；称大鼠体重，脱颈处死大鼠，剥离胸腺和脾脏，分别称重，以胸腺或脾脏的重量比上大鼠的体重，而得到胸腺指数或脾脏指数，结果以胸腺指数或脾脏指数表示。
(6)LPS和ConA诱导的T和B淋巴细胞增殖反应，无菌取脾脏用RPMI1640制备淋巴细胞悬液，在96孔培养板上，每孔加入100μl细胞悬液(终浓度为5×106·ml-1)及LPS(终浓度4mg·L-1)或ConA(终浓度3mg·L-1)，终容积为200μl，各设3个复孔，置37℃、5％CO2培养箱培养48h，诱导T、B淋巴细胞增殖。终止培养前2h，每孔加入20l MTT，培养结束后收集细胞，离心500g×10min，吸弃上清，每孔加入120ml冰醋酸，震荡30秒，选择波长为570nm的酶标仪检测其吸光度(A)，结果以3个复孔A的均值表示。
(7)IL-1的诱生与检测 制备大鼠腹腔巨噬细胞悬液(2×106·ml-1)，加入24孔培养板，每孔1ml，置37℃、5％CO2培养箱培养2h，弃取上清液，用D-Hank｀s液洗3遍，除去非粘附细胞，获单层细胞，然后各加入500l RPMI1640和LPS(终浓度4mg·L-1)，置37℃、5％CO2培养箱培养48h，诱导产生IL-1，收取上清(含IL-1活性)，-20℃保存待测。
无菌取C57BL/6J小鼠胸腺，用RPMI1640制备胸腺细胞悬液(5×106·ml-1)，在96孔培养板上，每孔加入100μl细胞悬液、50μl ConA(终浓度3mg·L-1)和50μl不同稀释度的待测上清，各设3个复孔，置37℃、5％CO2培养箱培养48h，终止培养前2h，每孔加入20μl MTT，培养结束后收集细胞，离心500g×10min，吸弃上清，每孔加入120ml冰醋酸，震荡30秒，选择波长为570nm的酶标仪检测其吸光度(A)，结果以3个复孔A的均值表示。
(8)IL-2的诱生与测定 无菌取胸腺用RPMI1640制备T淋巴细胞悬液，在24孔培养板上，每孔加入500μl细胞悬液(终浓度为5×106·ml-1)及500μl ConA(终浓度3mg·L-1)，终容积为1ml，置37℃、5％CO2培养箱培养48h，诱导大鼠T淋巴细胞产生IL-2，培养结束后，离心(2000rpm，10min)，收取上清(含IL-2活性)，-20℃保存待测。
无菌取C57BL/6J小鼠脾脏，用RPMI1640制备脾细胞悬液(2×106·ml-1)，取10ml放入培养瓶中，加入ConA(终浓度3mg·L-1)，置37℃、5％CO2培养箱培养48h，离心(1500rpm，10min)，取细胞分别加入盛有4ml的分层液中，离心(1500rpm，10min)，再吸取单层细胞用PBS液洗涤2次，再用RPMI 1640洗涤1次，配成1×107·ml-1的细胞悬液，按每孔100μl、50μl ConA(终浓度3mg·L-1)和50μl不同稀释度的待测上清，加入96孔培养板中。各设3个复孔，置37℃、5％CO2培养箱培养24h，终止培养前2h，每孔加入20μl MTT，培养结束后收集细胞培养结束后，离心500g×10min，吸弃上清，每孔加入120ml冰醋酸，震荡30秒，选择波长为570nm的酶标仪检测其吸光度(A)，结果以3个复孔A的均值表示。
(9)关节病理检查。
处死大鼠，取后足炎性踝关节进行HE染色，观察炎性关节组织的病理改变根据严重程度对滑膜增生、炎症、血管翳、软骨破坏进行评分。
炎症评分按0-3四级评分，0＝正常；1＝软组织较少炎细胞浸润；2＝中度炎细胞浸润；3＝明显炎细胞浸润。
软骨破坏评分按0-5六级评分，0＝正常；1＝甲苯胺蓝染色，轻微软骨丢失，无明显胶原分裂和软骨细胞丢失。2＝甲苯胺蓝染色，轻度软骨丢失，伴有焦点性胶原分裂和软骨细胞丢失。3＝甲苯胺蓝染色，中度软骨丢失，伴有多焦点胶原分裂和软骨细胞丢失。4＝甲苯胺蓝染色，明显软骨丢失，伴有多焦点胶原分裂和软骨细胞丢失。5＝甲苯胺蓝染色，严重融合性软骨丢失，伴有多焦点胶原分裂和软骨细胞丢失。
4.结果 4.1对足爪肿胀度的影响 1)大鼠足爪皮内注射CFA(10g/L)0.1ml，用足爪容积测量仪于致炎后d12、d16、d20、d24、d28定期检测大鼠足爪肿胀度。结果显示足爪肿胀度定期检测值模型组均较正常对照组明显增加(P＜0.05)，见图1。
2)阳性对照药强的松10mg/kg灌胃给药(ig)后第3天(d3)、d7、d11测量足爪容积，与模型组比较，足爪肿胀度均明显减轻(P＜0.05-0.01)，见图1。
3)组合物100mg/kg灌胃给药(ig)后d3、d7、d11测量足爪容积，与模型组比较，可见足爪肿胀度均明显减轻(P＜0.05-0.01)，见图1 4.2.对关节指数的影响 1)大鼠足爪皮内注射CFA(10g/L)0.1ml，按0-4五级评分，于给药后d3、d7、d11定期评估关节指数。结果显示关节指数评估积分模型组均较正常对照组明显增加(P＜0.01)，见图2。
2)阳性对照药强的松10mg/kg灌胃给药(ig)后d3、d7、d11评估关节指数，与模型组比较，关节指数评估积分均明显减少(P＜0.05-0.01)，见图2。
3)组合物100mg/kg灌胃给药(ig)后d3、d7、d11评估关节指数，与模型组比较，可见能减少关节指数积分(P＜0.05-0.01)，见图2。
4.3.对胸腺指数和脾指数的影响 1)大鼠足爪皮内注射CFA(10g/L)0.1ml，于给药d12后麻醉处死大鼠，称体重，取胸腺和脾脏称重，计算胸腺指数和脾脏指数。结果显示模型组脾脏指数明显大于正常对照组(P＜0.01)，但胸腺指数无明显差异。
2)阳性对照药强的松10mg/kg灌胃给药(ig)，与模型组比较胸腺指数明显减小(P＜0.05)，对脾脏指数无明显影响。
3)组合物100mg/kg(ig)，与模型组比脾脏指数无明显差异，与强的松组比较也无明显差异。
4)综合评价各受试药物对胸腺指数和脾脏指数的影响，阳性对照强的松有明显的免疫器官抑制作用，可明显减小胸腺指数，而组合物则无免疫器官的抑制作用。
4.4.对LPS和ConA诱导的T和B淋巴细胞增殖反应的影响 1)大鼠足爪皮内注射CFA(10g/L)0.1ml，于给药d12后麻醉处死大鼠，无菌取脾脏用RPMI1640制备淋巴细胞悬液，在96孔培养板上，每孔加入100μl细胞悬液(终浓度为5×106ml-1)及LPS(终浓度4mg·L-1)或ConA(终浓度3mg·L-1)，终容积为200μl，各设3个复孔，置37℃、5％CO2培养箱培养48h，诱导T、B淋巴细胞增殖。结果显示模型组与对照组比较，无论是LPS还是ConA诱导的T和B淋巴细胞增殖反应均受到明显抑制(P＜0.01)。
2)阳性对照药强的松10mg/kg灌胃给药(ig)，与模型组比较，无论是LPS还是ConA诱导的T和B淋巴细胞增殖反应均进一步受到明显抑制(P＜0.001)。
3)组合物组对ConA诱导的T和B淋巴细胞增殖反应有明显的增强作用，与模型组比较有显著差异(P＜0.05-0.01)，与强的松组比较则无明显差异。组合物组对LPS诱导的T和B淋巴细胞增殖反应无明显影响，与模型组比较无明显差异，但与强的松组比较有明显差异(P＜0.01)。
4.5对LPS诱导腹腔巨噬细胞IL-1βmRNA和TNF-αmRNA表达，Con A诱导胸腺细胞生成IL-2mRNA表达的影响 1)大鼠足爪皮内注射CFA(10g/L)0.1ml，于给药d12后麻醉处死大鼠，无菌取腹腔巨噬细胞培养，用LPS刺激巨噬细胞IL-1βmRNA和TNF-αmRNA表达，用RT-PCR法测定。另无菌取大鼠胸腺用RPMI1640制备T淋巴细胞悬液培养，用ConA刺激胸腺T细胞IL-2mRNA表达，用RT-PCR法测定。结果显示模型组与对照组比较，LPS刺激巨噬细胞IL-1βmRNA和TNF-αmRNA表达有明显提高(P＜0.01)，而ConA刺激胸腺T细胞IL-2mRNA表达无明显提高，见图3、图4。
2)阳性对照药强的松10mg/kg灌胃给药(ig)，与模型组比较，可明显抑制LPS刺激巨噬细胞IL-1βmRNA和TNF-αmRNA表达(P＜0.01)，对ConA刺激胸腺T细胞IL-2mRNA表达无明显影响，见图3、图4。
3)组合物对对TNF-αmRNA表达的抑制较强，对IL-1βmRNA表达的抑制作用较弱(见图3、图4)。
4.6.对全身病变体重变化，前肢、耳和尾部病变的发生率和严重度 1)分别于注射佐剂致炎后d16(给药前)、致炎后d20(给药d3)、致炎后d24(给药d7)和致炎后d28(给药d11)称体重，计算体重增量。增量(g)＝给药后体重-给药前体重。结果显示，模型组与对照组比较，体重明显下降；与模型组相同，组合物组体重也明显下降。
2)观察记录前肢、耳和尾部病变的发生率和严重度，除对照组，模型组和各受试药物组在致炎后随时间而发生后肢被注射部位不同程度的肿胀，部分发生溃疡或溃烂，前肢和耳发生轻度肿胀、部分大鼠尾巴发生结节，其发生率和严重度在给药前基本是一致的。在开始给药后，组合物组、阳性对照药强的松组全身病变的没有发生进一步的恶化，部分开始减轻。
4.7.关节病理检查 1)于注射佐剂致炎后d28(给药前)，即各受试药物给药d12后处死大鼠，取后足炎性踝关节进行HE染色，观察炎性关节组织的病理改变根据严重程度对滑膜增生、炎症、血管翳进行评分。炎症评分按0-3四级评分，0＝正常；1＝软组织较少炎细胞浸润；2＝中度炎细胞浸润；3＝明显炎细胞浸润。结果显示模型组滑膜增生明显，滑膜中有大量的中性粒细胞浸润和少量的血管翳生成以及轻度的软骨破坏；阳性对照药强的松能明显减轻AA炎症，减轻滑膜增生，减少中性粒细胞浸润以及血管翳生成；组合物组能明显减轻AA炎症，减轻滑膜增生，减少中性粒细胞浸润以及血管翳生成。
2)软骨破坏评分按0-5六级评分，0＝正常；1＝甲苯胺蓝染色，轻微软骨丢失，无明显胶原分裂和软骨细胞丢失。2＝甲苯胺蓝染色，轻度软骨丢失，伴有焦点性胶原分裂和软骨细胞丢失。3＝甲苯胺蓝染色，中度软骨丢失，伴有多焦点胶原分裂和软骨细胞丢失。4＝甲苯胺蓝染色，明显软骨丢失，伴有多焦点胶原分裂和软骨细胞丢失。5＝甲苯胺蓝染色，严重融合性软骨丢失，伴有多焦点胶原分裂和软骨细胞丢失。结果显示与对照组比较，模型组软骨破坏不明显，组合物组的软骨破坏也不明显。
本发明雷公藤芍药配伍组合物志愿者药物试验。
1、试验药物的制备 取雷公藤干品20Kg，加入甲醇回流提取，合并甲醇提取液，回收甲醇得甲醇提取浸膏；甲醇醇提取浸膏加入醋酸乙酯提取，合并醋酸乙酯提取液，回收醋酸乙酯得雷公藤提取物。把雷公藤提取物分成两等份，其中一份加入适当药用辅料后制备成约雷公藤胶囊(每粒相当于含雷公藤药材0.5g)约20000粒，另一份备用。
取赤芍药饮片180Kg，加入70％乙醇回流提取，回收乙醇得乙醇提取浸膏；乙醇提取浸膏加入醋酸乙酯提取，回收醋酸乙酯得到赤芍药提取物。把赤芍药提取物分成两等份，其中一份直接灌装胶囊制备成芍药胶囊(每粒相当于含赤芍药4.5g)约20000粒，另一份备用。
将上述雷公藤提取物和赤芍药提取物充分混合均匀，得雷公藤芍药配伍组合物，把雷公藤芍药配伍组合物灌装胶囊，得雷公藤芍药组合物胶囊(每粒相当于含雷公藤药材0.5g，芍药药材4.5g)约20000粒。
2、药物试验方法与疗效指标 选取了60位患类风湿关节炎志愿者进行临床观察，60位类风湿关节炎完全出于自愿，均签订了知情同意书，都符合美国风湿病协会类风湿关节炎修订分类标准(1987)和活动性类风湿关节炎标准，近期未接受糖皮质激素或抗类风湿关节炎药物治疗，无心、肝、肾等重要脏器疾病。随机分为两组，每组组30例。试验组(雷公藤芍药组合物胶囊组)每人每天3次，每次2粒雷公藤芍药组合物胶囊；对照组(雷公藤胶囊、芍药胶囊联合用药组)每人每天3次，每次2雷公藤胶囊、2粒芍药胶囊；连续服用12周。
观察指标晨僵时间；双手握力；关节压痛数；关节肿胀数；血沉(ESR，魏氏法)及C-反应蛋白(CRP，火箭电泳法)；肝功能检测谷丙转氨酶(ALT)；血液白细胞检测；观察不良反应等。于治疗前及治疗期间每隔4周重复检查并记录。
疗效标准主要以晨僵、握力、关节压痛数、肿胀数、ESR、CRP指标作为评价指标，以下降(握力为增加)50％作为有效计。评定级别晨僵时间＜15min；握力改善；无关节压痛；无关节肿胀；ESR＜20mm/h或30mm/h(女性)。上述5项中至少具备4项者为临床缓解；5项中至少3项达到上述有效者为显效；5项中至少2项达到上述有效者为有效；5项中不足2项达到“有效”者为无效。
3、结果 分别于治疗前和治疗后4、8、12周观察并记录检测结果，其结果如下表 表1患者疗效比较
从以上患者疗效比较可以看出，雷公藤芍药组合物治疗类风湿关节炎的效果要好于雷公藤与芍药分别制备成制剂后联合用药效果。
经过12周治疗后，不良反应观察情况如下 表2不良反应情况观察表
从不良反应对比可以看出，雷公藤芍药组合物治出现不良反应的人数比雷公藤与芍药分别制备成制剂后联合用药要少。
权利要求
1.一种用于治疗类风湿关节炎的配伍组合物，其特征是由雷公藤与芍药按照重量份比为雷公藤∶芍药＝0.01～100∶1的比例配伍而成。
2.根据权利要求1中所述的组合物，其特征是所述雷公藤是指卫矛科雷公藤属植物、雷公藤属植物提取物、雷公藤属植物加工成的药材和炮制品以及雷公藤属植物中含有的单一活性成分；所述芍药指毛茛科芍药属芍药组植物、芍药属芍药组植物提取物、芍药属芍药组植物加工而成的药材和炮制品以及芍药苷、芍药内酯苷、苯甲酰芍药苷、芍药新苷、羟基芍药苷、芍药花苷；芍药组植物包括草芍药、美丽芍药、芍药、多花芍药、白花芍药、川赤药、新疆芍药和窄叶芍药及其变种。
3.根据权利要求1所述的组合物，其特征是雷公藤与芍药配伍组合物，是雷公藤属植物、雷公藤属植物提取物、雷公藤属植物加工成的药材和炮制品以及雷公藤属植物中含有的单一活性成分任意一种，与芍药属芍药组植物、芍药属芍药组植物提取物、芍药属芍药组植物加工而成的药材和炮制品以及芍药苷、芍药内酯苷、苯甲酰芍药苷、芍药新苷、羟基芍药苷、芍药花苷任意一种配伍而成组合物。
4.根据权利要求1所述的组合物，其特征是该组合物可制成药剂学上的各种制剂，如片剂、胶囊剂、栓剂、颗粒剂、口服液、糖浆、合剂、口服混悬液、丸剂、酊剂、膜剂、散剂、乳膏剂、注射剂，并且可以和其他药物组成组合物制剂。
5.根据权利要求2中所述的组合物，其特征是雷公藤属植物中含有的单一活性成分包括雷公藤、昆明山海棠、黑蔓(东北雷公藤)和苍山雷公藤、变种雷公藤。雷公藤活性成分包括包括雷公藤内酯酮、雷公藤内酯醇、雷公藤乙素、雷公藤丙素、雷醇内酯、16-羟基雷公藤内酯醇、雷藤内酯四醇、雷藤内酯三醇、雷藤氯内酯、12-表雷藤内酯三醇、异雷公藤内酯四醇、13，14-epoxide 9，11，12-trihydroxytriptolide、新雷公藤内酯四醇、雷公藤内酯二醇酮、雷酚内酯、雷酚内酯甲醚、雷酚酮内酯、雷酚新内酯、异雷酚新内酯、雷酚萜、雷酚萜甲醚、neatripeonoterpent、雷酚萜醇、11-hydroxy-14-methoxyldehydroabietane、雷藤二萜酸、山海棠酸、雷酚二萜酸、wilforol E、F、tripfinin B、triptoquinone(A、B、C、D、E、F、G)、triptobenzene(A、B、C、D、E、F、G、J、K)、雷公藤苯L、M、N、异雷酚内酯、雷藤素、山海棠二萜内酯A、16-hydroxy-19，20-epoxy-kaurane A、雷公藤定碱、雷公藤次碱、雷公藤吉碱、雷公藤春碱、雷公藤碱庚、雷公藤碱戊、雷公藤碱己、雷公藤宁碱、雷公藤精碱、1-desacetyl wilfordlne、1-desacetyl wilfortrlne、2-debenzoyl-2-nicotinoylwilforine、雷公藤碱辛、triptonine A、triptonine B、雷公藤碱壬、peritass-inesA、异雷公藤春碱、雷公藤明碱、雷公藤榕碱、卫矛碱、异雷公藤定碱、雷公藤定宁D、E、F、G、H、苯乙烯南蛇碱、呋喃南蛇碱、苯代南蛇碱、南蛇藤别肉桂酰胺碱、黑蔓酯碱、雷公藤植碱、雷公藤康碱、雷公藤红素、扁朔藤素、3，24-二氧代木栓烷-29-羟酸、polpunonic acid、2-hydroxy-polpunonic acid、wilforol A、demethyl-zeylasteral、demethylzeylastemne、23-nor-6-oxo-demethyl-zeylastemne、3-hydroxy-2-oxo-3-fridelen-20α-carboxylic acid、tripterygone、2，3-dihydroxy-friedel Δ1，3，5，(10)，7-6-actone-29-oic acid、orthosphenic acid、萨拉子酸、triptotin C、wilforol B、wilforol D、3β，29-dihydroxy-DB-friedolean-5-en、Congomnine、卡漆-5-烯-3β，28-二醇、雷公藤内酯甲、乙(wilfortide A、B)、山海棠内酯(hypoglaulide)、黑蔓内酯(regelide)、雷藤三萜酸A、B、C(triptotriterpenic acid A、B、C)、3-epikatonic acid、雷二羟酸甲酯(triptodihydroxy acidmethyl ether)、黑蔓酮酯甲、乙、丙、丁、黑蔓醇酯甲、乙(regelindiol A、B)、demethylregelinn、oleana-9(11)，12-dien-3-one、齐墩果酸乙酸酯、山海棠萜酸、tripterygicacid A、齐墩果酸乙酸酯、山海棠萜酸、tripterygicalidA、齐墩果酸、3-oxo-22α-hydroxy-Δ12-OleaHen-29-oicacid、3β，2α-二羟基-Δ12-齐墩果烯-29-羟酸(3β，2α-dihydroxy-Δ12-oleanen-29-oic acid)、3-acetyl-oleanolic acid、wifoml C、3α，24-di-hydroxy-olean-12-en-28-oic acid、2α，，3α，24-trihydroxy-Δ12-ursene-28-oic acid、3β，15β-dihydroxy-Δ12-oleanen-28-oic acid、3β-hydroxy-olean-11，13(18)-diene、乌索-3β，5α-二醇、triptotriterpenoidal lactone A、zeorin、triptolactone、萨拉子酸-3-乙基醚。
全文摘要
本发明提供一种用于治疗类风湿关节炎的配伍组合物及其制备方法，由雷公藤和芍药配伍成药方。所述的雷公藤与芍药的配伍其重量份比为雷公藤∶芍药＝0.01～100∶1的比例。本发明治疗类风湿关节炎效果不仅好于雷公藤制剂单用效果，而且好于白芍总苷联合雷公藤多苷治疗类风湿关节炎的效果，同时可以大大减轻或避免雷公藤制剂单用引起的毒副作用。
文档编号A61P19/04GK101810686SQ20101016793
公开日2010年8月25日 申请日期2010年5月7日 优先权日2010年5月7日
发明者周海滨, 江海龙, 杨海玲, 张新明 申请人:宁波立华制药有限公司