目录
1.1 Dapoxetine暴露在空气中发生Cope消除产生的“后天”杂质（Semmelweis University）
1.2 光照催化Oxcarbazepine产生的“后天”杂质（Breckenridge Pharmaceutical）
1.3 铜离子催化Olanzapine产生的降解杂质（Lilly Research Laboratories）
2.1 进样小瓶介导的 Berry pseudorotation（Merck ResearchLaboratories）
3. 在色谱柱上发生的降解反应（on-column degradations）
3.1 Oxycodone -“后天”杂质的引入导致峰前沿（Purdue Research Center）
3.2 Litronesib-胺类化合物的亚硝基化（Lilly Research Laboratories）
一、背景介绍及可能引入“后天”杂质的环节
杂质研究在药物质量研究中的重要性毋庸置疑，直接与药物的三大基本要素“安全、有效、可控”息息相关。笔者根据自身在药物杂质分离、纯化与结构解析方面的工作经历，将药物研发过程中遇到的杂质从另外一个角度（来源方面）分为“先天”杂质与“后天”杂质两种：将样品中本身含有的杂质称为“先天”杂质（样品中固有的杂质），而从天平称量样品、稀释剂溶解定容样品、通过注射器与微孔滤膜过滤样品、将样品转移至液相进样小瓶，以及样品最后与流动相接触经过色谱柱到达检测器这些过程中产生的杂质称为“后天”杂质（液相人工产物）详见Fig.1。这些“后天”杂质的出现最直接的后果是会让我们对样品的含量与稳定性产生一定的误判，使我们的检测结果丧失准确性，严重的甚至会阻碍项目的顺利展开。
本文将主要从我们实验过程中可能产生“后天”杂质的三个主要环节（配样、液相进样小瓶和样品进入色谱柱）着手，结合一些比较经典的案例与大家交流一下药物研究过程中“后天”杂质引入的原因以及如何避免使其产生。
Fig.1. 可能引入“后天”杂质的环节
样品溶液在放置过程中不稳定从而产生降解杂质，是我们在实验过程较为常见的问题，也是这里所说的引入“后天”杂质最常见的情况之一。关于这方面的例子也比较多，因此在这里就不一一举例。在这部分想和大家分享：Dapoxetine暴露在空气中发生降解、光照催化Oxcarbazepine降解、金属离子催化Olanzapine降解这三个例子。
1.1 Dapoxetine暴露在空气中发生Cope消除产生的“后天”杂质（Semmelweis University）
样品外观的变化：András[1]等发现Dapoxetine碱基暴露在空气中保存一段时间后样品由原本的无色油状物变为棕黄色，同时TLC检测发现有降解杂质出现，其中一个为主要的降解杂质。
降解杂质的结构鉴定：首先通过硅胶柱对其进行纯化，后利用LC-MS，1D-NMR，2D-NMR等波谱手段确定其结构为1-(2E)-cinnamyloxynaphthalene，另外一个次要的降解杂质结构鉴定为1-(2Z)-cinnamyloxynaphthalene（Fig.2），二者为一对异构体。
Fig.2. Dapoxetine及其降解物的结构
降解机理推测：（1）Hofmann消除反应还是Cope消除反应：胺类化合物的消除反应主要可以分为Hofmann 消除反应与Cope消除反应。但是由于经典的Hofmann消除反应需要先将胺类化合物与碘甲烷反应生成季铵盐，然后在氧化银作用下（加热）通过E2消除最后生成烯烃与胺，由于其条件的苛刻性，因而排除了Dapoxetine通过Hofmann消除反应产生1-(2E)-cinnamyloxynaphthalene的可能。与此同时Cope消除反应是通过叔胺的氮氧化物发生立体选择性消除生成烯烃与羟基胺，且该反应条件温和在室温下即可发生，因而推测Dapoxetine主要通过该机理发生降解；（2）机理的验证：作者首先通过m-CPBA将Dapoxetine氧化为Dapoxetine-N-oxide，室温下放置几天后，用1H-NMR检测发现样品中的确有1-(2E)-cinnamyloxynaphthalene生成，进而验证了该降解反应机理的可能性（Fig.3）。
Fig.3. Dapoxetine降解产生1-(2E)-cinnamyloxynaphthalene的机理
1.2 光照催化Oxcarbazepine产生的“后天”杂质（Breckenridge Pharmaceutical）
问题的发现：陈洪等[2]在研究首仿药Oxcarbazepine的期间发现主峰前面有一个未知杂质（RT2.7min, >0.2 %）且峰面积有时大有时小（Fig. 4）。
Fig.4. Oxcarbazepine的色谱图
未知杂质的结构鉴定：（1）稳定性：通过Flashcollector 收集该未知杂质馏分时发现其在酸性条件下稳定，在碱性条件下会进一步降解为其他的杂质。（2）后经MS,NMR数据推测该杂质的结构如Fig.5 所示，将Oxcarbazepine结构中羰基的邻位CH2也氧化为羰基，形成邻二酮的结构。
Fig.5. Oxcarbazepine及其未知杂质的结构
未知杂质出现的原因：（1）确认是否为“后天”降解杂质：在实验期间发现同样的样品，保存在桌面上的样品颜色变深，保存在冰箱中的样品颜色没有变化。进一步经HPLC检测发现，保存在冰箱中的样品无该未知杂质的峰，而保存在桌面上的样品中该未知杂质的含量为1.27%，因而推测该杂质实际为一个“后天”降解杂质，可能受到光或温度的影响。（2）诱导因素：经过进一步的考察发现，该未知杂质是在光照的作用下降解产生的，光照24h,48h该未知杂质的含量可分别达到0.38%、0.97%，避光保存的样品中无该杂质出现（Table1）。
Table1 光照对Oxcarbazepine中未知杂质（RT2.7min）含量的影响
1.3 铜离子催化Olanzapine产生的降解杂质（Lilly Research Laboratories）
问题的发现：据Steven[3]等报道Olanzapine的原料药及其与Fluoxetine的复方制剂样品在不同实验室的检测结果（含有SDS的离子对色谱条件）中偶尔会出现一个未知杂质峰，其含量有时会超过Olanzapine峰面积的0.1%，因而可能会对产品的质量检测结果产生较大的干扰。由于这个未知杂质是偶发的出现，因此推测其并非为样品中固有的杂质峰，而是一个“后天”杂质。
Fig. 6. Olanzapine-fluoxetine复方胶囊在离子对条件下的液相色谱图（含有未知杂质，乙腈-SDS缓冲盐体系）
可能原因的初步推测：后发现使用不锈钢管路的液相的检测结果中未知杂质1的含量最高，而且换成peek管路后这个未知杂质的含量会降低，因而推测是微量的金属催化产生的该“后天”杂质。
推测的原因的验证：通过将Olanzapine与9种较为常见的金属元素分别混合，在原有的稀释剂（乙腈/水=1:1）体系下模拟反应（Fig.7）。结果表明Olanzapine在Cu的催化下会产生相同的未知杂质1与2；同时发现将稀释剂中的乙腈/水替换为甲醇/水后未有降解杂质的产生。因而，根据上面的实验结果初步推测这两个“后天”产生的降解杂质是Olanzapine在二价铜离子与乙腈的同时作用下催化产生的。
Fig.7. Olanzapine中产生“后天”杂质的原因验证
未知杂质的结构鉴定：通过FT-ICRMS，UV，PHPLC，NMR等手段最终鉴定未知杂质1为一价铜离子（Cu+），未知杂质2为Olanzapine结构中噻吩环上甲基氧化羟甲基的氧化产物，详见下图（Fig.8）。备注：由于是在离子对的色谱条件下，所以一价铜离子（Cu+）在色谱柱上会有保留，而不是在死体积处出峰。
Fig.8. Olanzapine与硫酸铜反应后的反应液
降解机理的推测：根据Cu2+催化Olanzapine反应的过程中样品溶液的颜色会发生较大的变化，结合文献推测降解过程中有氮自由基阳离子过渡态出现，综上分析可能的降解机理为Olanzapine在Cu2+与乙腈的同时作用下首先生成Olanzapine氮自由基阳离子，同时Cu2+被还原为Cu+（未知杂质1），Olanzapine氮自由基阳离子会进一步在空气中氧气的作用下生成hydroxy-olanzapine（未知杂质2），详见Fig.9。
Fig.9. 二价铜离子与乙腈催化Olanzapine发生降解的机理推测
如何避免该“后天”杂质的产生：文章作者通过验证发现，当配样的样品体系中Cu2+的含量超过100ppb的时候，降解产生的未知杂质1（Cu+）的含量即可达到Olanzapine峰面积的0.1%。
预防措施：（1）根据Cu2+的来源-经过对试验用试剂，流动相用水，液相系统中Cu2+的含量测定后发现（ICP-OES），洗瓶机用水中的Cu2+的含量可高达820ng/ml.（2）在样品配置过程中加入金属离子络合剂EDTA,提前将样品溶液中的Cu2+络合起来，从而避免降解反应的发生;（3）也可交以将稀释剂中的乙腈替换为甲醇。当然我们在实际的操作中也可以将多种措施结合起来。
研究背景：液相玻璃进样小瓶在每个分析实验都很常见，现在不同品牌的生产厂家也很多，通常我们认为进样小瓶是惰性的，不会对样品的稳定性产生影响，而且在开发验证方法时不会考虑不同品牌的液相进样小瓶对检测结果的影响，但是Rebecca[4]等在研究抗丙肝药物sofosbuvir的中间体（1，结构见Fig.10）时发现，同一份样品溶液，两种不同的保存过程a）在液相进样小瓶中放置24h；b）在容量瓶中放置24h，结果发现样品a中会产生一个新的降解杂质（0.1%，Fig.10），而b样品无新的降解杂质出现，从而引发了作者对“不同品牌液相进样小瓶对该样品稳定性的影响”问题进行了思考。
Fig.10. sofosbuvir中间体-Cmpd1 的结构及其乙腈溶液放置24h后的色谱图
a）在液相进样小瓶中放置24h；b）在容量瓶中放置24h
降解杂质的结构解析：通过1D,2D-NMR 以及购买合成的对照品比对二者的出峰时间，最终确定该降解杂质的结构为sofosbuvir中间体1的差向异构体-P的手性中心构型发生了变化（2，结构见Fig.10）。
产生降解杂质的原因排查：
（1）液相进样小瓶的影响：选取3个不同厂家制造的5批玻璃液相进样小瓶（A，B-C,D-E）以及聚丙烯塑料内插管分别分装同一份样品，并随着时间变化考察降解杂质Cmpd2的含量变化趋势。结果表明分装在聚丙烯塑料内插管中的样品中未有Cmpd2的产生，而3个不同厂家制造的玻璃液相进样小瓶中分装的样品中Cmpd2含量差异比较大，放置一个星期后Cmpd2的含量从1%-29%不等，其中以B厂家的进样小瓶降解程度最大29%（Fig.11）。从而可以判断Cmpd2是样品乙腈溶液与玻璃进样小瓶接触后产生的“后天”杂质。
Fig.11.不同厂家制造的玻璃液相进样小瓶（A，B-C,D-E）以及聚丙烯塑料内插管随时间变化对Cmpd2含量的影响
（2）玻璃渗出物还是玻璃本身：为了进一步判断是否是玻璃进样小瓶中的渗出物促使降解物Cmpd2的生成，作者设计了Fig.12所示的实验方案：将乙腈分装至B厂家的进样小瓶中，保存19天后，将乙腈取出继续用于溶解Cmpd1配样，HPLC检测结果表明无降解杂质2的生成；同时将乙腈浸润后的进样小瓶再次用于配样，HPLC仍然检测到降解杂质2的生成，但是降解程度比最初实验中观察到的要低,提示玻璃中的部分reactivecomponents被浸润到乙腈中。因而可以推测：并非是玻璃进样小瓶中的渗出物直接促使降解物Cmpd2的生成，同时玻璃本身在降解过程中起到关键的作用。
（3）渗出物pH值的变化：结合文献中报道的含有P原子的手性中心构型翻转的实验条件，推测如果本实验中液相进样小瓶渗出物的pH值会增加（变碱性），则会使得降解杂质Cmpd2的生成变得更为合理，因而作者进一步验证了上面提到的3个不同厂家制造的玻璃液相进样小瓶（A，B-C,D-E）中水浸润一段时间后水溶液pH的变化，结果如Table2所示，pH的增加程度与Fig.11中的降解杂质Cmpd2的含量趋势一致；
Fig.12. 排查降解产物是玻璃渗出物还是玻璃本身的作用
Table2.不同厂家的玻璃液相进样小瓶（A-E）中水浸润后pH的变化
降解机理的推测：（1）验证碱性对降解杂质Cmpd2的促进作用：HPLC检测结果发现向样品中添加三乙胺后会马上生成降解杂质Cmpd2，20h后Cmpd2的含量可达到37.6%；与此同时将三乙胺替换为碱性更强的二异丙基胺后，相同的时间点下比添加三乙胺样品中降解程度较弱，说明降解过程除了与碱性相关外，碱的空间位阻大小也会对降解程度有影响；（2）降解机理（Berrypseudorotation）：碱性条件下，碱会进攻Cmpd 1中的磷原子，生成一个三角双锥体，然后经过Berrypseudorotation使的P原子处的手性中心发生翻转，从而生成“后天”杂质Cmpd2（Fig.13）。
Fig.13. “后天”杂质Cmpd2可能的生成机理
如何避免该“后天”杂质的产生：结合该降解反应的影响因素及其可能形成机理，推测可行的预防措施如下：（1）由于该降解反应需要在碱性环境下进行，因而可以在配样过程中加入少量的酸来避免降解反应的进行。
3.1 Oxycodone -“后天”杂质的引入导致峰前沿（Purdue Research Center）
研究背景：作者展开研究的时候现有的针对Oxycodone的分析方法多含有离子对试剂，但是离子对试剂的使用使的色谱柱损害的比较快，因而Kevin[5]等试图开发一种不含有离子对试剂的分析方法，经过摸索后开发的方法流动相条件为MeOH-0.05M KH2PO4 (pH 3.0)，0.5% MTBE，0.1%TEA，但是在方法开发的过程中遇到峰前沿很严重的情况，因而对峰前沿的原因展开调查。
柱温对峰形的影响：作者发现改变柱温会对色谱图中峰的数目、Oxycodone的峰形产生较大的影响，在0℃，30℃，60℃三个不同的柱温条件下，主峰的拖尾因子会由30℃时的0.7增加到60℃时的0.95，而且60℃时峰形变好后，原本被包裹在主峰中的两个工艺杂质峰也被首次检测到，与此相反0℃时主峰的前面会多出两个未知杂质峰（Fig.14）。
未知杂质峰的结构鉴定与机理推测：基于上面观察到的不同柱温条件下色谱图之间的差异，推测0℃时主峰的前面会多出的两个未知杂质峰为Oxycodone烯醇异构化产物。（1）通过观察氘代Oxycodone-d3在酸性条件甲醇溶液中的稳定性，室温下放置一星期后，但是质谱检测结果显示Oxycodone-d3在中的氘原子没有被交换掉（Fig.15）；（2）同时经过质谱检测发现0℃时主峰的前面会多出的两个未知杂质峰分别为Oxycodone与水、甲醇形成的半缩酮（Fig.15）。经过上述分析可以推测Oxycodone在柱温30℃时的峰前沿现象是由于Oxycodone与流动相中含有的水、甲醇形成溶剂加合物（动态的平衡）造成的。
Fig.14. Oxycodone在不同温度下的色谱图
Fig.15. Oxycodone与流动相接触产生的“后天”杂质
3.2 Litronesib-胺类化合物的亚硝基化（Lilly Research Laboratories）
研究背景：色谱技术的快速发展促使了耐酸碱（耐受宽pH值范围）色谱柱的出现，从而使得广大的分析工作人员在方法开发时有了更多的选择，特别是含有脂肪胺结构片段的样品时，因为这一类的样品在大于pKa的色谱条件下会有较好的峰形以及分离度。David[6]等在开发针对Litronesib（含有脂肪胺结构）的分析方法时就开发了一个高pH值流动相的色谱方法（WatersX-Bridge C18，0.18% 氨水-水（pH11）：乙腈）。但是在该条件下经常在主峰的后面检测到一对未知杂质（Fig.16）,且不同的色谱柱检测结果表明这两个杂质的含量相差很大，因而作者针对这个问题展开了研究。
Fig.16. Litronesib在高pH值流动相下的色谱图以及两个未知杂质的UV吸收图
未知杂质的结构解析：（1）紫外吸收曲线：这两个杂质的紫外吸收曲线相同，且与Litronesib的紫外吸收极为类似，表明Litronesib结构中的主要发色团1,3,4-thiadiazoline未发生变化。（2）通过高分辨质谱确认这两个未知杂质为同分异构体，其分子式比Litronesib多NO少1H，因而初步推测这两个未知杂质的可能结构为Litronesib中的仲胺发生了亚硝基化（Fig.17）。（3）通过对推测的结构进行定向合成，经对比发现在HPLC,LC-MS中与样品中的两个未知杂质出峰时间一致。
Fig.17. Litronesib主峰后两个未知杂质的结构
验证是否是“后天”引入杂质：（1）样品配制：将样品稀释液由原本的流动相（高pH值）替换为中性或酸性溶液后，未知杂质峰消失；然而新配置的溶液中也会出现这两个未知杂质峰，因而可以排除这两个未知杂质是样品与稀释液反应生成的（Fig.18）；（2）酸性流动相下的HPLC/LC-MS检测结果：将流动相pH值调整为酸性后，LC-MS检测结果发现未观察到这两个未知杂质峰对应的离子峰。因而可以推测这两个未知杂质为高pH值条件下在色谱上降解产生的杂质峰。（3）其他厂家的色谱柱：将原本的WatersX-Bridge C18色谱柱替换为Phenomenex Gemini C18、WatersXterra MS C18以及Waters Acquity CSH C18，结果发现在上述色谱柱中均会发生上文提到的降解反应。
Fig.18. 验证是否为“后天”引入的降解杂质
发生降解反应原因：（1）Litronesib发生亚硝基化的氮元素的来源：经过如Fig.19所示的验证方案，结果表明氨水是亚硝基化氮的来源，同时乙腈也是降解反应发生需要的因素；（2）Griessassay测试表明流动相排出液中含有NOx的存在，因而根据上述实验的结果可以将该降解反应表示如Fig.19所示，Litronesib与氧气、氨水、乙腈在色谱柱上发生了亚硝基化的产应，从产生了这两个后天降解杂质。（3）其他影响因素:通过进一步的考察发现，在20℃、30℃、40℃、50℃、60℃等不同的柱温条件下，温度越低降解杂质含量越大；改变有机相的比例，样品在色谱柱上的保留时间越长降解杂质含量越高。（4）其他含有胺的样品：结果表明包括Paroxatine、Setraline、Clozapine等在内其他六种结构中含有胺的样品，在该高pH值色谱条件下均会发生类似的亚硝基化降解反应。（5）柱筛板以及进样次数对降解反应的影响：一根新的WatersX-Bridge色谱第一针进样时亚硝基化降解杂质含量最低，随着连续进样次数的增加，亚硝基化杂质的含量会慢慢增加，当连续进样10针之后，亚硝基化杂质的含量趋于稳定；同时作者还考察了柱筛板对降解反应的影响，结果如Fig.20所示，因而可以推测柱筛板也参与到亚硝基化的降解反应中。
Fig.19. Litronesib发生亚硝基化的氮元素的来源验证
Fig.20. 柱筛板对降解反应的影响
可能的降解机理：经总结分析后推测，含有胺类结构片段的化合物在色谱柱上发生亚硝基化降解反应的可能机理如Fig.21所示，乙腈、氧气、氨水等首先反应生成三氧化二氮，三氧化二氮与Litronesib在柱筛板上进一步发生亚硝基化反应。
Fig.21. Litronesib发生亚硝基化的可能反应机理
可能的避免措施：结合该降解反应的影响因素及其可能形成机理，推测可行的预防措施如下：（1）将氨水替换为碳酸氢铵，去掉亚硝基化氮的来源；（2）尝试将样品稀释液以及流动相中的乙腈替换为甲醇。
三、总结与讨论
除此之外，容量瓶或者液相进样小瓶未清洗干净、仪器方面的残留产生的干扰峰也是上面提到的引入“后天”杂质途径的一种，但是这种情况相对比较容易排查，因此在这里未进行进一步展开论述。通过上述的案例分析，不难发现“后天”杂质的引入现象在我们实验过程普遍存在，而且有些“后天”杂质颇为“神秘”。希望通过这篇小结能够起到抛砖引入的作用，引起大家对“后天杂质引入”问题的思考，揭开这些“后天”杂质（HPLC人工产物）的神秘面纱。
备注：由于个人水平有限，书写过程中如有不足之处请大家批评指正，这篇小结仅供抛砖引玉之用，也希望能与各位同行共同交流、共同进步！
参考文献：
[1] A. Darcsi, Á. Rácz, S. Béni,Identification and characterization of a new dapoxetine impurity by NMR:Transformation of N-oxide by Cope elimination，J. Pharm. Biomed. Anal. 134 (2017)187–194.
[2] 陈洪，以岭药业，药品申报中CMC分析文件的准备和实践案例分享及发补经验培训四20170519.
[3] S.W. Baertschi, B.A. Olsen, T.J.Wozniak, N. Toltl, C. O’Shea, P.J. Jansen. Formation of copper(I) from tracelevels of copper(II) as an artifactual impurity in the HPLC analysis ofolanzapine, J. Pharm. Biomed. Anal. 125 (2016) 186–193.
[4] R. Arvary, I. Mangion. Theimportance of vial composition in HPLC analysis: An unusual case of phosphorouspseudorotation, J. Pharm. Biomed. Anal. 134 (2017) 237–242.
[5] K. Brogle, R.M. Ornaf, D. Wu, P.J.Palermo, Peak fronting in reversed-phase high-performance liquidchromatography: a study of the chromatographic behavior of oxycodonehydrochloride, J. Pharm. Biomed. Anal. 19 (1999) 669–678.
[6] D.P. Myers, E.M. Hetrick, Z.M.Liang, C.E. Hadden, S. Bandy, C.A. Kemp, T.M. Harris, S.W. Baertschi. On-columnnitrosation of amines observed in liquid chromatography impurity separationsemploying ammonium hydroxide and acetonitrile as mobile phase, J. Chromatogr. A1319 (2013) 57–64.
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