超详细！手把手教你做RNA pull-down

随着高通量测序技术的发展，越来越多的长链非编码RNA（long non-coding RNA,lncRNA）被注释出来，其广泛的生物学功能也成为近年来的研究热点。RNA与蛋白质的相互作用是发挥功能的主要作用机制之一，而作为检测RNA与其结合蛋白相互作用的一种重要的手段—RNA pull-down，具有不可或缺的意义。

    简而言之，RNA pull-down实验就是先将RNA进行标记（如生物素探针标记），再与细胞裂解液共同孵育，从而形成RNA-蛋白质复合物，之后再分离复合物得到蛋白质，通过western blot 或 mass Spectrometry检测蛋白质的技术。目前RNA pull-down技术已成为研究miRNA、lncRNA与相互作用蛋白的主要技术手段之一。

    那么，如此高大上的实验，我们到底该怎么下手呢？莫方，且听本迪一一道来~

首先，你需要合成体外转录RNA。

   由于后续实验需要将RNA做探针标记，所以需要提前准备好体外转录的RNA片段，就好比是先把“靶子”准备好，才能抓住射过来的箭嘛！

   那我们常规的做法是：外包给公司合成…（毕竟这个难度系数有点高），可以向Takara公司提供RNA过表达的质粒，质粒浓度会有一定要求,一般要超过200ng/μl，总量超过5μg,第一次合成的RNA一般20 μg，足够做两次RNA pull down了。

其次，需要订购一个试剂盒。

Pierce™ RNA 3' End Desthiobiotinylation Kit（Thermo 20163）.这个试剂盒是利用T4 RNA连接酶将单个脱硫生物素化的胞苷二磷酸连接到单链RNA的3’端。3’端的末端标记不干扰RNA结构，因此，该生物素标记不会影响RNA与蛋白的互相作用。每一次反应需要50pmol RNA。孵育时间的延长，以及在标记反应中加入DMSO，可优化RNA的标记效率。

    接下来就是细致的前期准备过程，需要注意的是：RNA pull down过程需要严格杜绝RNase,以防止操作过程中RNA的降解。因此在整个实验步骤中所用到的EP管、枪头、镊子均需要DEPC水处理并灭菌，所有试剂均需要DEPC水配置并灭菌！处理后的各种耗材，需要在两周内用掉，超过两周需要重新处理。正式实验过程中，操作台需要用RNaseZAP擦净，以去除环境中的RNA酶的影响。

前期准备工作第一天

1. 配制新鲜的DEPC溶液：

将DEPC原液（生工）1ml,加入ddH2O中配置成1L的DEPC溶液，溶液中放入1.5mlEP管、0.2mlPCP管，枪头等；置于摇床中，慢速摇过夜；

前期准备工作第二天

1. 取出DEPC溶液及实验耗材，分别灭菌；

2. 用灭菌后的DEPC水配制如下试剂：

c）1M DTT：

DTT 溶液用0.01M 乙酸钠（PH=5.2）配制，1g DTT粉剂加入6.48ml 乙酸钠溶液中，溶解后过滤，分装后冻存于-20℃；

d）5M NaCl 50ml:

14.61g NaCl粉末加入50ml DEPC水中；

e）PBS（DEPC水配制）， 250ml。

东西配制齐全后，接下来终于可以开始实验啦，下次我们将接续讲解具体的操作步骤，期待的搓手手！