石蜡切片是最基本的切片技术,石蜡切片制备流程有:组织取材固定,脱水,浸蜡,包埋,切片,染色,封片。在病理学中,组织只有经过固定,才能完成随后的一系列制作过程,直至切片的最后完成。
为什么要进行组织固定?
1. 防止组织的自溶现象以及细菌的腐蚀;样本离体后在自身酶以及空气中的细菌共同作用下会立刻开始腐败和自溶,显微镜下,早期自溶组织的细胞界限不清晰,细胞似浊肿状,胞浆中有颗粒或空泡形成,然后出现染色性的改变。晚期的变化类似腐败,细胞失去界限,胞核丧失染色性,严重影响对结果的判断。
2. 保存细胞固有的物质,凝固、沉淀细胞内或组织液,糖原等,使细胞或组织基本上保持与生活时的物质一样;细胞内有细胞核、线粒体、高尔基体、内质网、溶酶体、细胞骨架,抗原、糖元等。这些物质,如果不及时固定,很容易丧失,尤其是溶酶体,很容易受到破坏,更重要的是导致抗原失活,发生弥散的现象。
3. 固定可以使组织硬化,方便切片;刚离体的组织,大多数都是柔软的,尤其是胃肠道的组织,固定不及时粘膜和肌层很容易分开。
4. 对某些具有传染性的标本,能防止疾病的扩散;病理标本、种类繁多,成份复杂,各种病例都有,具有传染性的病种也不少。对于此类标本,应进行彻底的固定后,再行取材,特殊样本特殊对待。
5. 可增强染色;组织经过及时的固定,最终可见到切片有鲜艳的染色,而如果有一批未经及时固定的组织,将看到最终的结果是,核染色不清楚,灰淡色,由此可得结论,固定可以增强染色的作用。
关于固定有哪些注意事项?
1. 固定必须及时:组织离体后,必须立即固定,越快越好;
2.固定液的选择:最常用的固定液10%中性缓冲福尔马林液,适用大多数样本。(关于固定液的分类以及特殊样本固定液的选择,以后再说);
3. 固定液的量:必须大于样本体积的4-20倍;
4. 固定液的浓度:浓度配比必须准确,过高过低都会影响组织的形态和固定的效果;
5.样本的大小:一般不超过1.5x1.5x0.4cm,过大过厚固定液很难渗透,如胃、肠等管腔结构,应切开固定;
6.固定的时间:穿刺及活检小样本固定时间6小时即可,一般样本固定时间在24—48小时,最多不超过72小时;
7. 固定的温度:室温固定,温度越高,固定速度越快,所需的时间就越短,但也加快组织的过度收缩,破坏细胞内的抗原和核酸;固定液温度低,固定速度就慢,过慢的固定速度同样也会使固定液未渗透到组织发生变性;
8. 具有一定的立体外形、包膜的样本,固定液浓度过高会引起周围组织收缩,影响固定液浸透到组织深处,造成组织中央固定不佳;固定液浓度过低,容易造成组织边缘水肿而导致组织中央固定不佳。
9. 固定液浓度过高,组织容易发硬,细胞收缩明显。固定液浓度过低,会导致组织水肿,还容易引起组织变质;
每个实验技术员都能容易地把组织细胞固定起来,但是,要完全掌握理解组织固定技术是一件比较困难的事。需要自己多操作,总结经验。
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