手把手教你SCI必备实验荧光素酶报告基因引物设计

荧光素酶报告基因实验

    该实验是通过将预测能够与miRNA结合的靶基因3’UTR序列插入载体中萤火虫荧光蛋白的3’UTR通过监测荧光素酶的活性变化，即可获得miRNA是否对靶基因3'-UTR产生调控作用。

    当我们研究的miRNA和质粒中的插入的3’UTR序列结合后，miRNA会通过和插入的3’UTR序列结合从而抑制萤火虫荧光蛋白的翻译最终造成荧光值的下降。反之，当miRNA与报告基因（包含靶标区域突变）无法形成有效的互补配对时，荧光素酶活力将与对照无显著区别。

今天小编就来讲解一下如何设计野生型荧光报告引物。以mmu-miR-21与靶基因GPR64为例。

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靶基因序列的预测

①首先，进入Targetscan网站预测mmu-miR-21a-5p的靶基因。

②以mmu-miR-21a-5p的第一个靶基因GPR64为例，点击sites in UTR。                             

③mmu-miR-21a-5p可以结合靶基因GPR64的3’UTR,并且获得的结合位点序列。

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UCSC网站查询靶基因的3’UTR全长

①进入UCSC网站，输入基因名称。

②GPR64别名为Adgrg2，点击图中蓝色加深基因名称。

③点击Genimic Sequence进入，获得基因序列。

④如图所示，设定查询基因 5’UTR，外显子以及3’UTR序列。其中5’UTR与3’UTR为字母小写，CDS区字母大写。

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设计引物

①根据获得的3’UTR种查找到mmu-miR-21a-5p的结合位点，如图黄色区域（注该基因有两处结合位点，以第二处为例）。这里要注意，不一定要插入靶基因的3’UTR全长。可以只插入包括miRNA结合位点前后200bp左右的序列，如选用红色序列作为扩增区域引物。

②红色引物序列选择前可以在NCBI进行blast基因特异性。

③根据实验需求，选择荧光素酶报告载体，如 psiCHECK-2。确定酶切位点，如XhoI和NotI。根据限制性内切酶的识别位点，在引物两端加上相应识别位点序列以及相应的保护碱基。

XhoI识别位点 

NotI识别位点

即可获得最终设计引物：