这次我们介绍一下质谱样品的制备!
好的样品,是实验成功的首要条件,尤其是组学这类对样品要求极高的实验。
那么,我们要怎样采集处理样品呢?这里我们给大家列举了质谱检测中几种常见的样品准备方式
选取新鲜组织,剔除无关的干扰组织(血管、脂肪、结缔组织等);
PBS/生理盐水漂洗,去除血渍和污染物,用无尘吸水纸吸去表面液体;
剪切成边长 0.5 cm 小块或 100 mg 左右小块;
液氮速冻5 min以上,并于-80℃保存。
常规动物组织(脑、心、肝、脾、肺、肾、肌肉、皮肤等):
定量蛋白质组-送样量>200 mg;
修饰蛋白质组-送样量>500 mg。
地上部分在样本离体前用无菌水清洗杂质,水干后采集样本;
地下部分在样本离体后,用预冷的PBS清洗杂质,无尘纸吸干后采集样本;
去除干扰部分(非目标组织及衰老、霉变等);
剪切成小块,锡纸包裹或放入冻存管中;
液氮速冻5 min以上,并于-80℃保存。
常规植物组织(幼嫩的根、叶、花、愈伤组织等):
定量蛋白质组-送样量>1g;
修饰蛋白质组-送样量>2 g。
悬浮细胞
培养至2-5×105/ml,收集到15 ml离心管中,4℃,400 g-1000 g离心5-10 min,去上清;
用10 ml PBS洗3次;
1 ml PBS重悬细胞后转移到新的1.5 ml离心管;
同等条件离心,将上清去除干净;
PBS重悬,液氮速冻,并于-80℃保存
贴壁细胞
覆盖度70-90%,去培养基培养皿用10 ml PBS洗3次,培养皿倒扣,将液体控干;
培养皿置于冰上,胰蛋白酶消化,PBS悬浮细胞;
收集到15 ml离心管中,4℃,400 g-1000 g离心5-10 min,去PBS;
1 ml PBS重悬后转移到新的1.5 ml离心管;
同等条件离心,将上清去除干净;
PBS重悬,液氮速冻,并于-80℃保存。
悬浮/贴壁细胞,定量蛋白质组-送样量>1×107个细胞或体积>50ul细胞沉淀;
磷酸化蛋白质组-送样量>5×107个细胞或体积>200ul细胞沉淀;
乙酰化、泛素化蛋白质组>1×108个细胞或体积>500ul细胞沉淀。
血浆样本
EDTA抗凝剂和蛋白酶抑制剂的血常规管采集血液;
轻轻地上下颠倒混匀 8-10 次;
立即4℃,1600 g离心 10 min;
将血浆转移到离心管中,加入蛋白酶抑制剂,混匀,瞬时离心。
血清样本
真空采血管收集血液;
轻轻地上下颠倒混匀5-6 次;
4℃,静置15-30 min;
4℃,1600 g离心10 min;
上层淡黄色血清转移到离心管中,加入蛋白酶抑制剂,混匀,瞬时离心。
血浆/血清样本:
定量蛋白质组-送样量>500 ul。
离心法或其他方法分离菌和培养基;
收集菌体到15 ml离心管,用10 ml PBS洗3次;
用1 ml PBS 重悬菌体,转移到1.5 ml离心管中离心,去上清,记录菌的湿重或体积;
PBS重悬,每管100 ul分装,液氮速冻,并于-80℃保存。
微生物菌体:
定量蛋白质组-送样量湿重>100mg或体积>100ul;
修饰蛋白质组-送样量湿重>300mg或体积>300ul。
胶点胶条
胶点/胶条或者泳道皆可,建议考马斯亮蓝染色(条带清晰,无降解)。
IP / Co-IP / Pull-down样本
蛋白洗脱液蛋白总量>5ug,蛋白溶液进行SDS-PAGE电泳,下方两种电泳方式任选其一即可。
蛋白洗脱液,分离胶5cm(不含浓缩胶的SDS-PAGE),切5cm胶条,于1.5ml离心管中。
蛋白洗脱液,SDS-PAGE标准的胶,切下目标条带,放入1.5ml离心管中.
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