剖析和靶向EZH2在癌症中的多种功能

通常认为Enhancer of zeste homologue 2（EZH2）是Polycomb repressive complex 2（PRC2）复合物主要催化亚单元，通过其SET结构域催化组蛋白H3赖氨酸27的三甲基化修饰（H3K27me3），从而来保持下游靶基因的沉默状态。在许多种人类癌症中EZH2呈现高表达并且促进癌症发生和恶变。因此靶向抑制EZH2的酶活是药物设计的理想靶点。目前已经有多个靶向EZH2 SET结构域的小分子抑制剂在进行开发，并且进入肿瘤治疗的临床试验，其中EPZ-6438是首个被FDA批准上市的EZH2 的小分子抑制剂，用于治疗不适合完全切除局部晚期的上皮样肉瘤和滤泡性淋巴瘤。除了依赖于PRC2复合物的转录抑制功能之外，EZH2还具有PRC2非依赖性的转录激活功能。例如EZH2在前列腺癌（prostate cancer）和三阴性乳腺癌（triple negative breast cancer）中可以作为cofactor结合转录因子AR或者NF-κb（RelA and RelB）来共同激活下游基因的表达，但是针对于EZH2结合转录因子的具体机制目前尚不清楚，针对于靶向抑制EZH2多功能的小分子抑制剂需要开发。

2022年2月24日，北卡罗来纳大学教堂山分校 (University of North Carolina at Chapel Hill) 由Greg Wang和西奈山伊坎医学院的Jian Jin领导的两个研究团队在Nature Cell Biology杂志上在线发表题为EZH2 noncanonically binds cMyc and p300 through a cryptic transactivation domain to mediate gene activation and promote oncogenesis 的研究论文，揭示了EZH2在急性骨髓性白血病（AML）致癌机制中的经典及非经典功能，并且通过设计和开发蛋白质水解靶向嵌合体（PROTAC）小分子药物来探索和抑制EZH2的多重功能。

研究人员首先分析了血液肿瘤AML细胞（MV4;11和EOL-1细胞系）中EZH2 和H3K27me3的染色质结合区域，发现EZH2除了和H3K27me3共定位（定义为EZH2-ensemble区域, 约占70%）以外还有部分结合区域没有H3K27me3的共定位（定义为EZH2-solo区域, 约占30%）。进一步发现EZH2-solo区域和开放染色质修饰H3K27ac, H3K9ac以及H3K4me3具有良好的共定位，暗示了EZH2可能同时存在转录激活功能。通过进一步Motif search 分析，发现在EZH2-solo区域中高度富集了cMyc-MAX的转录因子结合位点（CACGTG motif）。作者通过CO-IP以及GST-pull down 技术实验证实了EZH2和cMyc存在直接的蛋白-蛋白相互作用且不依赖于PRC2复合物。并且进一步在AML细胞以及PDX样品中证实了EZH2-solo 区域与cMyc染色质结合区域具有良好的共定位。

该团队通过软件分析发现在EZH2 氨基酸序列N端有一个转录激活结构域（transactivation domain, TAD），包括了两个保守的TAD motif （φφxxφ, φ指疏水性氨基酸，x指任意氨基酸）。通常TAD结构域存在于转录因子中并起转录激活的作用，研究人员通过荧光素酶报告基因的方法验证了EZH2-TAD具有和VP16相同水平的转录激活功能，同时进一步发现EZH2-TAD介导了EZH2与cMyc，p300，SMARCA4等cofactor的结合，而突变关键的氨基酸位点F145或者F171则明显的影响了其转录激活以及与cofactor的结合能力。此外，EZH2-TAD对于EZH2结合下游基因的启动子区域，下游基因的转录激活，以及AML细胞的增殖也都非常重要。

RNAseq结果显示EZH2和cMyc共同调控了一系列重要的基因，其中包括了TPD52和IRF2BPL，分析显示这些基因和AML病人的生存具有明显的相关性。然而通过EED degrader （UNC6852）或者EZH2酶活抑制剂（C24）靶向EZH2经典功能均不能下调EZH2和cMyc共同调控的靶基因，但是通过p300抑制剂（A485）却可以显著下调这些基因表达。这些结果显示出EZH2抑制剂的局限性，和开发靶向EZH2多重功能的药物小分子的重要性。

基于此，研究人员使用PROTAC技术来靶向EZH2的催化与非催化功能。PROTAC是一项很有应用前景的靶向蛋白降解的方法，能将E3泛素连接酶招募到靶蛋白附近，形成三元复合物，诱导靶蛋白泛素化，从而被蛋白酶体识别和降解。该团队通过合作并筛选得到了新型EZH2小分子降解剂MS177。研究人员发现MS177不仅可以靶向降解PRC2复合物组成部分（包括EZH2，SUZ12，EED），下调H3K27me3水平，同时还可以有效地降解cMyc。MS177不仅可以减弱EZH2在ensemble 区域结合能力，还能更显著的减弱在solo区域的结合能力，从而显著影响了PRC2和cMyc介导的基因表达模式。

接下来，作者评估了MS177对于AML细胞系和病人样本（patient sample）的抗增殖能力，发现同小分子抑制剂相比较，MS177具有更高效的细胞增殖抑制能力，有效地抑制细胞周期和促进细胞凋亡。通过血液瘤异种移植和患者源性异种移植血液瘤（PDX）等多种小鼠动物模型实验进一步评估了MS177的体内肿瘤抑制效果，结果显示与对照组相比，MS177处理组明显抑制了肿瘤的增长，并且显著的延长了小鼠的存活时间，具有良好的抗肿瘤效果。

综上所述，该研究进一步阐明了EZH2在癌症中的多种功能（如上图所示），即既可以形成经典的PRC2复合物，介导下游基因的沉默；也可以形成非经典复合物（EZH2-TAD-cMyc-coactivator），介导了另一套下游基因的激活。EZH2的这一多功能可能在许多肿瘤中普遍存在，而这两个EZH2复合物对于EZH2介导的促癌功能都非常重要，也因此解释了EZH2酶活抑制剂在肿瘤抑制上的局限性。而基于PROTAC开发的EZH2降解剂MS177既可以抑制PRC2依赖的传统催化功能，同时也能破坏不依赖于PRC2非传统复合物的形成，因此MS177具有比小分子抑制剂更有效的肿瘤细胞生长抑制效果，为后续进一步针对EZH2依赖性肿瘤的治疗方法提供了新的策略。

北卡罗来纳大学教堂山分校Greg Wang和 西奈山伊坎医学院Jian Jin博士为本文的共同通讯作者。北卡罗来纳大学教堂山分校王俊博士和西奈山伊坎医学院余旭芬博士为共同第一作者。Wang和Jin团队参与共同研究。合作实验室包括北卡罗来纳大学教堂山分校的Ling Cai课题组、洛克菲勒大学的Robert G. Roeder 课题组和台湾National Yang Ming Chiao Tung 大学的Wei-Yi Chen课题组。

原文链接：

https://www.nature.com/articles/s41556-022-00850-x.