本文发表于2017年5月召开的欧洲动物细胞技术组织的会议（European Society for Animal Cell Technology Meeting）。
治疗用蛋白药物的开发是一个复杂的过程，而构建一个适合于生产的高表达稳定细胞株是第一步也是很重要的一个环节。挑选到理想的高表达克隆后，就要开始选择商业化培养基或者定制培养基进行细胞培养优化。传统的细胞株开发及培养基优化流程存在着众多不足，耗时耗力，难以满足企业加快项目进度的需求。因此，采用何种策略能够减少试验时间并优化工艺流程，便成为试验人员一开始就需要思考的问题。
在此，我们分享了一个细胞株构建和培养基开发上游工艺开发方案，基于CHO细胞无血清化学成分限定的商品化平台培养基和定制化培养基开发能力，通过整合细胞株开发和培养基优化过程，实现了提高蛋白表达量和增加效率的目的，并省去了传统工艺开发中的培养基悬浮驯化和基础培养基筛选的环节，节约了时间。为了更好更直观具体地反映这一整合的细胞株开发和培养基优化流程，我们使用两个治疗性抗体 - 抗CD20抗体和抗Her2 抗体，作为说明。
Overview of Integrated Cell Line Development and Media Optimization Process
稳定转染
- 将GS-CHO宿主细胞悬浮适应到添加了4mM 谷氨酰胺的BalanCD CHO Growth A（美国IrvineScientific公司，货号91128）细胞培养基中，在37度，5% CO2，120rpm摇瓶中培养。
- 重链和轻链通过pD2531载体构建（ATUM）的抗CD20和Her2抗体。
- 细胞通过常规转染试剂在BalanCD Transfectory CHO瞬时转染培养基（美国IrvineScientific公司，货号 91147）中进行转染操作，转染48小时后，更换到添加MSX、不添加谷氨酰胺的BalanCD CHO Growth A细胞培养基中进行筛选。
- 通过Vi-Cell观察活细胞密度，通过ForteBio检测抗体浓度
半固体培养基克隆挑选
- 使用不含谷氨酰胺的CloneMedia CHO Growth A培养基（货号K8830）。
- 在第0天，将稳定转染的细胞接种到96孔板，在第0、1、8和13天通过CloneSelect Imager拍照记录。
Fed-Batch 平台培养策略
- 使用BalanCD CHO Growth A培养基在125ml摇瓶中（30ml工作体积）培养。
- 起始接种密度：3 x 105cells/ml，补料培养基： BalanCD CHO Feed4补料培养基（美国IrvineScientific公司，货号94134）。
- 补料策略：4次补料共添加20% v/v。
- 第6天降温到33度，营养和代谢物通过BioProfileFlex检测，当细胞活率低于70%时，结束培养。
抗体N-糖型分析
- 通过PredictorMabSelect Sure从上清中纯化抗体，使用LabChip GXII和Glycan Assay Release and Labeling Kit，HTglycan LabChip reagent Kit进行检测。
补料培养基的开发和优化
- 通过HPLC分析培养基中的氨基酸组成和消耗情况。
- 通过添加Spent media中的限制性氨基酸得到一系列原型补料培养基用于后续试验。
图1: Fed-Batch培养中稳定细胞Pool的表现。
- 用aCD20或aHER2抗体质粒转染GS-CHO细胞，经过筛选，当细胞活率恢复到大于90%开始使用BalanCD CHO Growth A 和Feed 4进行Fed-Batch平台培养并检测抗体浓度。
- 数据表明，Fed-batch培养中，MSX加压处理使Fed-Batch培养的表达量提到了5-6倍。
图2: 96孔板半固体单克隆挑选。
A - aHER2抗体单细胞/孔的图片。
B - 克隆结果的总结。克隆效率根据所有的1个细胞/孔的比例计算。
高分辨率的图像证明了单克隆性。两个抗体的克隆形成率均在11%左右。
图3: 细胞克隆Fed-Batch培养结果。
Top克隆被挑选用于Fed-Batch培养。抗体表达量显示如图（Mean ± STD; n = 2）。
使用基础培养基BalanCD CHO Growth A和补料Feed4的进行Fed-Batch平台培养，Her2抗体克隆的表达量在2.2 - 4.0g/L之间，CD20的表达量在1.4 - 1.8g/L之间。
图4 蛋白质量分析
aHER2克隆的N-糖型图谱，克隆具有明显的异质性N-糖型。
产品质量应该成为细胞克隆挑选的指标之一。
图5：补料培养基优化结果。
A 消耗培养基分析。红色代表主要的限制性氨基酸。
B 通过4个优化后的原型补料培养基Fed-Batch培养CD20克隆的结果。
消耗培养基分析确定了Fed-Batch培养中的限制性氨基酸，通过配方优化，最终D原型培养基将表达量提高了33%，为开发个性化培养提供了良好的思路。
- 半固体克隆形成率为11%左右，细胞克隆生长的图片记录为证明单克隆性提供了关键证据。
- 通过IrvineScientific公司的Fed-Batch平台培养工艺（基础培养基BalanCD CHO Growth A+ 补料培养基Feed 4），摇瓶中获得的表现最好的前5个aHER2克隆的表达量在2.2-4.0g/L之间，aCD20抗体克隆的表达量在1.4-1.8g/L之间。
- 针对挑选的稳定细胞克隆，通过Spent Media Analysis进行补料培养基优化后，表达量提高了33% 。
- 试验数据证明，通过在BalanCD CHO GrowthA 中进行细胞株构建和Fed-Batch培养，可以省去传统工艺中的培养基驯化适应和生长培养基筛选的过程（上图中紫色的部分），简化了操作的复杂度，缩短了细胞培养工艺开发的时间。
如果您希望
- 索取PDF原文或相关的细胞培养基开发的文献/Poster（如下图）以获得更多细胞株构建和培养基开发的技术细节，
- 或希望测试文中的培养基样品（CHO Growth A和Feed 4）
欢迎与美国IrvineScientific公司负责人联系（联系方式见文末）。
Jeff Feng
Area Manager - Greater China and SEA
+86 13816964879
j.feng@irvinesci.cn
参考资料：
CHO MEDIA PLATFORM FACILITATES INTEGRATED CELL LINE DEVELOPMENT AND MEDIA OPTIMIZATION.
Irvine Scientific上市全球首个无动物源的、化学成分限定的T细胞培养基
Irvine Scientific推出最新一代CHO细胞浓缩补料以支持高效生物制药工业生产
从北京到世界: CHO细胞的“中国往事”
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