五、对离子通道结构与功能的深入研究
上世纪 80 年代初期，利用膜片钳技术已从功能上证实了离子通道的存在，然而揭示这种功能活动的结构基础，是许多生物学技术结合应用的成果。
1. 通道蛋白一级结构的研究 ―― 膜片钳技术与生化学和基因分子克隆技术的结合 为了研究离子通道的分子结构，首先需要利用生化学方法从富含某种通道蛋白的组织中提取和纯化通道蛋白（图 8 ）。这其中最关键的环节是找到富含钠通道蛋白的组织和具有高度选择性与亲和力的毒素或药物。例如，乙酰胆碱通道蛋白和电压门控钠通道蛋白是两个最早被分离纯化的通道蛋白，这主要得益于发现了电鳐电器管和电鳗电器管分别富含乙酰胆碱通道蛋白和电压门控钠通道蛋白，而 a 银环蛇毒和河豚毒又分别是能与上述两个通道蛋白以高特异性和高亲和力结合的两个毒素。然而通道蛋白都是分子量很大的蛋白质，利用化学分析法测定全部氨基酸序列显然是不可能的。
图8 钠通道蛋白的纯化
对通道蛋白分子结构的进一步认识是利用了 1973 年 Cohen 等创建的 DNA 重组技术（ DNA recombination technique ）。即通过测定纯化的通道蛋白肽链的部分氨基酸残基序列，推衍出对应的 DNA 序列，选择部分序列制备通道蛋白的寡聚核苷酸探针，用于从不同组织来源的 DNA 文库中筛选同源的通道蛋白基因，再推衍出通道蛋白肽链的氨基酸残基序列（图 9 ）。 1982 年， Noda 等用 DNA 重组技术，首先完成了编码 N 2 - 型乙酰胆碱受体阳离子通道基因的分子克隆，这是第一个被阐明氨基酸序列的通道蛋白。 1984 年， Noda 等又克隆了编码电压门控钠通道 a 亚基的基因。 1987 年， Tanabe 等利用同样的方法，完成了兔骨骼肌 L 型钙通道 a 1 亚基基因的克隆。钾通道的分离一直遇到困难，这是因为钾通道种类多，密度低，又找不到高特异性结合的毒素或药物，因此无法通过上述途径制备 DNA 探针，它的分子克隆是经由从基因到蛋白的途径。这一工作是从果蝇的一种突变型钾通道（ shaker 钾通道）的研究取得突破的。 Papazian 和 Tempel 等首先利用染色体步移等遗传学方法找到编码这种通道的基因在染色体上的位置，并选择合适的 DNA 片断序列制备探针，于 1987 年首次从果蝇克隆出钾通道的突变基因，从而开始了钾通道的基因研究。
图9 离子通道基因的分子克隆
2. 离子通道结构－机能关系的研究 ―― 膜片钳与基因突变技术的结合 由于基因技术与膜片钳技术的有机结合，对离子通道的研究已经不再满足于基因的克隆，而是深入到基因所编码的每一个蛋白质在通道中的具体作用和通道蛋白的结构 - 机能关系，从分子的角度阐述通道的生理学特性。例如，利用点突 变（ site - directed mutagenesis ）技术将钾通道蛋白 N 端的亮氨酸用谷氨酰胺取代，或将 N 端的 20 个氨基酸残基全部删除，电压门控钾通道的快速率（毫秒级）失活即被消除（图 10 ），据此提出了钾通道快速率失活（ N 型失活）的 “ 球 - 链 ” 机制（ ball and chain theory ）。再如 NGK2 和 DRK1 是两种生理特性完全不同的钾通道，用位于 NGK2 第 5 和第 6 跨膜段（ S5 和 S6 ）之间的 437 至 461 位 24 个氨基酸残基置换 DGK1 相应部位的残基，所得嵌合体通道的孔道特性（单通道电导、与阻断剂结合特性等）与供体 NGK2 的相似，而其它特性（激活、失活电压依赖性等）则仍保持 DGK1 的特征，结果支持 S5 和 S6 间的胞外环，是构成电压门控通道孔道部 分的肽段。与上述类似的研究至今仍在继续。
图10 钾通道 N 型（快速型）失活的消除
A ：天然的电压门控钾通道电流，显示激活和失活过程；
B ：删除 N 端 20 个氨基酸残基后该通道的失活过程被消除
随着生物学技术的快速发展和与膜片钳技术的有机结合，离子 通道的研究已经取得了令人瞩目的进展。膜片钳 与基因克隆、点突变、基因嵌合等分子生物学技术相结合，揭示了作为细胞电活动物质基础的离子通道分子结构和结构 - 机能关系；膜片钳技术与离体脑片技术结合，可以定位研究神经元离子通道，还可以进行神经元突触联系的研究，与使用培养的或急性分散的神经元相比具有不可替代的优势；膜片钳技术与离子荧光成像技术的结合，促进了细胞电活动与胞内离子浓度、离子分布和细胞功能之间相互关系的研究；膜片钳技术与原子力显微镜技术的结合，将使我们以高分辨率洞悉离子通道的三维结构和结构 - 机能关系。这一切都给当代细胞生物学研究带来了诱人的前景和巨大的前进动力。
参 考 资 料
1 . 贾宏钧 , 王钟林 , 杨期东 主编 . 离子通道与心脑血管疾病 . 北京 : 人民卫生出版社 , 2001
2 . Keynes RD , Aidley DJ. Nerve and Muscle. 3rd e dition, Cambridge University P ress, 2001
3 . 刘振伟编著 . 实用膜片钳技术 . 北京 : 军事医学科学出版社 , 2006
(吴博威 供稿)
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