前沿：前几天我们推送了西南大学农学与生物科技学院的关于qPCR引物设计数据库“再也不用自己设计qPCR引物了，请收藏！”今天收到热心粉丝“莫莫先生”写的具体使用方法，在这里表示感谢。
材料：
1、http://www.ricedata.cn/ （国家水稻数据中心）
2、http://rapdb.dna.affrc.go.jp/ （水稻注释数据库）
3、http://rice.plantbiology.msu.edu/index.shtml （水稻基因组数据库）
4、http://biodb.swu.edu.cn/qprimerdb/ (qPCR引物设计软件）
5、https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi?LINK_LOC=BlastHome （引物比对网站）
方法：以设计COLD1的qPCR引物为例。
1、寻找COLD1基因号
2、点击登入号Os04g0600800
3、点击Os04t0600800-01并复制
4、打开qPrimerDB database
5、依次选择水稻qPCR引物数据库
6、进入水稻数据库，点击GeneID
7、输入COLD1基因号
8、点击Filter,找到目标区域
9、点击Os04t0600800-01,选择引物。红色框表示引物GC含量，一般选择45左右；绿色框是上下游引物的TM值一般58左右；黄色框可以显示更多的引物选项；蓝色框表示扩增片段大小，一般200以内；紫色框为引物覆盖度，一般选100；黑色框是跨外显子数目，依据自己需要选择。
10、选择好引物，点击蓝色框框primerID,获得全面信息。（primer pair sequences)
11、复制引物序列，即为COLD1 qPCR引物
12、NCBI-blast验证引物
13、输入引物
14、依次如下选择,Get primers
15、如图所示，引物特异性很好！可以送公司合成啦！以此类推只要有准确的基因号就能找到对应的qPCR引物。
附录：qPrimerDB database说明
Web界面和用法
浏览功能：在我们的数据库中，147个生物体按分类和字母顺序排列。为了提高浏览效率，147种生物最初被分为三类：动物、植物和其他真核生物。将80种动物进一步分组包括4种鸟类和爬行动物、10种鱼类、17种昆虫、37种哺乳动物和12种其它动物的组，而66个植物被分成几组包括39种双子叶，18种单子叶植物和9个其它植物。此外，147个生物按照基于科学名称的字母顺序进行分类。有两种方式来浏览所有的有关资料，对目标生物qPCR引物。我们以模型植物“A.拟南芥”为例，展示了QprimerDB中的浏览功能。
第一个方法，用户可以获得感兴趣的生物信息通过在“主页”搜索对应的分类学和科学名称。依次单击“植物”、“双子叶植物”和“A. thaliana ”。“结果”页面显示25 995个基因的最佳引物对的详细信息，包括引物ID ，基因ID，引物水平，上游引物序列，下游引物序列，引物覆盖度，扩增体大小，扩增GC含量，前引物TM，反向引物TM，前引物ΔG，反向引物ΔG，和跨越外显子的数目。25995个记录显示在2600页中，每页有10条条目（默认情况下），可以通过将“显示行”更改为20, 30, 50、100, 200或500来调整。也可以通过选择“排序升序”或“排序降序”来更改在“结果”表的每个列中显示的值的顺序，并且可以通过不同的方式搜索列中的关键字， 选择“包含”、“不包含”和“相等”等术语。通过引物和ID列中蓝色矩形中的超链接，可以为每个基因获得更详细的信息。例如，用户可以通过单击引物ID A.thaliana.005900.v1的超链接查看AT1G72390最佳引物的详细信息，包括基因描述、引物描述、“所有AT1G72390引物”的超链接和扩增序列及模板序列。对于AT1g72390所有引物的表可以通过点击超链接的AT1g72390'中的'最好的'页面查看拟南芥引物或“所有引物AT1g72390在细节 引物A.thaliana.005900.v1。然后，所有引物的详细信息可以通过点击感兴趣的引物ID查看。
使用第二种方法，用户可以通过在导航栏中选择“浏览”来浏览感兴趣的，然后从“收藏夹”、“植物”或“通过字母”页面选择“A.拟南芥”。浏览步骤所描述和第一个方法一样。
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