根据挽救的现象,我们把Rescue实验分为表型挽救和机制挽救。
表型挽救是说A技术回复了B技术所造成的表型,比如X基因的过表达回复了X基因的干扰所造成的表型,这里说的表型比如细胞增殖表型、周期、自噬等等;
机制挽救是说A技术回复了B技术所造成的下游分子表达、活性或者定位,比如X基因的过表达回复了X基因的干扰所造成Y基因的上调,P通路的激活,或者Z分子的定位。
根据要解决的问题,我们把Rescue实验分为分为单因素挽救和多因素挽救。
单因素挽救是指围绕单一因素展开的A技术和B技术的回复,X基因的过表达回复了X基因的干扰所造成的表型和表达调控,就是围绕X基因所展开的表达层次的回复。广义来说,这里的单因素除了基因外,还可以是信号通路(比如通过对TGF-β通路进行激活和抑制挽救细胞纤维化的表型)、表型(比如通过促进和抑制细胞自噬研究自噬对肿瘤的影响)、菌群(比如通过菌群移植挽救菌群缺失造成的IBD) ,甚至是药物。
多因素挽救就复杂一些了,我们以两因素为例,比如为了证明M分子通过调控N分子的表达影响细胞增殖,就可以通过干预M分子挽救N分子干预所造成的细胞增殖能力变化来证明。多因素挽救实验是研究分子间调控关系常做的实验之一。
我们粗略总结下就是:利用对某个(些)因素的已知干预手段(加法和减法)来研究某个(些)因素对下游结果的影响。我们在包括单因素和多因素的黑箱中研究因素之间的“因果报应”,有点像犯罪后判刑,表现好减刑的意思。
上面是理论,下面我们举例看Rescue实验在课题设计中的应用。
案例1
SOX2过表达导致DPSC细胞增殖、侵袭和粘附能力上调,而SOX2 siRNA挽救了上述表型。单因素表型挽救。
案例2
miR-92b抑制物(inhibitor)可以抑制胶质瘤细胞的增殖、迁移、侵袭,并促进细胞凋亡;而miR-92b和靶基因PTEN的双敲实验(double knockdown)挽救了miR-92b抑制物造成的上述细胞表型。双因素表型挽救。
案例3
在荧光素酶报告基因实验中,miR-663类似物(mimics)下调了靶基因 TGFβ1野生型3′-UTR的荧光素酶活性,而TGFβ1的3′-UTR中miR-663结合位点的突变挽救(上调)了荧光素酶活性。双因素机制(活性)挽救。
案例4
miR-221通过激活PTEN-Akt信号通路促进胰腺癌细胞增殖,而PTEN-Akt信号通路抑制剂LY294002挽救了miR-221过表达导致的细胞增殖。双因素表型挽救。
案例5
好了,挽救实验在文章中的案例就到这里了,我们看基金。在(基金篇)S5E50:基金评审意见“人话翻译机”一文中,我们说到在基金申请中在方案设计上常遇到问题是研究太浅,不够深入:
A对P通路分子和P通路状态调控;(最浅)
A通过与P通路中的P1分子直接作用调控激活P通路;
挽救实验:
A过表达 沉默对P通路分子表达、通路激活和增殖表型的影响;
P1分子干预(激活、抑制、干扰、过表达)对A促进肿瘤增殖的影响;
P通路干预(抑制剂、激活剂)对A促进肿瘤增殖的影响;
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