PCR实验室核酸检测常见异常的扩增曲线原因分析及解决方案！

作者：张国华

PCR实验室的设计原则

PCR实验室一般设置四个区域：试剂储存和准备区、标本制备区、扩增区、扩增产物分析区。

进入PCR实验室各工作区域应当严格按照单一方向进行：试剂储存和准备区→标本制备区→扩增区→ 扩增产物分析区。

试剂储存和准备区（1区）：主要用于贮存试剂的制备、试剂的分装和扩增反应混合液的准备，以及离心管、吸头等消耗品的贮存和准备。

标本制备区（2区）：主要用于核酸（RNA、DNA）提取、贮存及其加入至扩增反应管。

扩增区（3区）：主要用于cDNA合成、DNA扩4增及检测。

扩增产物分析区（4区）：主要用于扩增片段的进一步分析测定，如杂交、酶切电泳、变性高效液相分析、测序等。

PCR实验原理

PCR是在模板DNA、引物和4种脱氧核苷酸存在的条件下，依赖于DNA聚合酶的酶促合反应，将待扩增的DNA片段与其两侧互补的寡核苷酸链引物经“高温变性—低温退火—中温延伸”三步反应的多次循环，使DNA片段在数量上呈指数增加，从而在短时间内获得所需的大量的特定基因片段。理论上讲，经过 n 个循环之后，模板量就会达到2的n次方。

PCR实验的工作流程是：标本采集 → 标本运输 →标本处理 →核酸提取 → 反转录（RNA 病毒）→扩增 → 结果读取。

PCR扩增曲线

扩增曲线的横坐标代表扩增循环系数(Cycle)，纵坐标代表荧光强度。正常的扩增曲线是比较平滑的S型曲线。典型的扩增曲线分为基线期、指数增长期、线性增长期、平台期四个阶段。

基线(baseline)是扩增曲线中的水平部分，通常是3至15个循环之间的信号水平。

荧光阈值(threshold)是荧光扩增曲线上人为设置的一个值，它主要代表明显超出基线的扩增信号水平。

Ct值(C代表扩增循环系数Cycle，t代表荧光阈值threshold)是每个反应管内扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。

异常扩增曲线分析

1、单基因翘尾且Ct值较大或单基因翘尾无Ct值，如下图。

原因分析：

①人为原因：操作不规范导致交叉污染，比如存在阳性质控、阳性标本残夜或者气溶胶通过加样枪、脏手套等造成携带污染。

②标本原因：标本含有少量病毒(目的基因浓度低)，标本存在其他干扰物质。

③仪器原因：提取仪器或生物安全柜污染、机器出现故障、存在非特异性扩增等。

④试剂原因：反应液放置时间过长或反复冻融。

解决方案：

①排除是否存在污染然后重新提取样本，如果复检后扩增曲线是阴性直线则说明之前的翘尾是非特异性扩增或存在污染；如果复检后扩增曲线与之前的翘尾保持一致说明样本中含有较低的病毒浓度。

②更换试剂，可以使用不同厂家试剂进行比对排除试剂原因。

③如果是自动基线设置问题可以采取手动调整基线的方法，重新定义基线即可正常。如果是环境污染可以更换生物安全柜加样、加样器、枪头等。

2、某孔或某列标本的内标线不起，如下图。

原因分析：

①人为原因：操作不规范(样本加错位置或漏加、样本没有充分混匀、选错扩增程序、漏分反应液或点错核酸列)。

②标本原因：标本采集不当(没有采到人体细胞)、标本保存不当(核酸已降解)。

③仪器原因：提取仪器出现故障、加模板时吸到磁珠造成干扰。

解决方案：

①重新提取样本并上机检测。

②如果重新提取样本依然无内标，联系采样人员重新采样。

③检查试剂是否充分混匀、分装准确，必要时可双试剂检测排除试剂原因。

3、内标曲线离散不集中、各曲线高低异常不平。

原因分析：

①人为原因：操作误差(标本加样前没有充分混匀、反应液配制时没有充分混匀或新旧反应液混合使用、提取试剂储存温度低影响核酸提取效率)。

②标本原因：采样误差。

③试剂原因：试剂过期、试剂保存不当等。

解决方案：

①排除是否存在人为原因导致内标曲线离散不集中，复查以后整体内标曲线相对集中，说明标本加样前没有充分混匀、反应液配制时没有充分混匀；复查以后整体内标曲线依然离散不集中，说明存在采样误差。

②检查试剂或更换试剂检测，必要时双试剂检测。

4、某孔或多列扩增曲线出现剧烈或明显的曲折，如下图。

原因分析：

①人为原因：八连管有气泡

②仪器原因：卤素灯老化所致发射光源不稳定、电压不稳定、受到振荡仪共振影响等。

解决方案：

①仔细检查八连管，避免产生大量气泡。模板加完以后，必须离心再扩增。

②检查仪器和实验室电压情况。定期进行仪器保养和维修，避免配件老化。

5、弱阳性质控或阳性质控一条或多条扩增曲线未起，如下图。

原因分析：

①人为原因：使用前没有充分混匀、加样量不准确、反复冻融质控品。

②质控品原因：不同品牌的质控品导致扩增片段不同，同一品牌不同批号的质控品混用导致扩增片段存在批间差异，质控品保存不当造成降解等。

解决方案：

①首先确认所使用的质控品是第三方质控品还是试剂盒自带质控品，若为第三方质控品，如为首次跟该品牌扩增试剂匹配使用，则首要考虑质控品与试剂的匹配问题，如之前已使用，则主要关注质控品保存和批号；若为试剂盒自带质控品，则主要关注质控品保存和批号，同时确认是否误用其它品牌试剂质控品。

②更换新的质控品，保证是同一品牌的质控品。

③使用前充分混匀，加样量做到准确无误。不可反复冻融质控品，避免使用放置时间过长的质控品

6、某孔或某批三条扩增曲线整体往上爬长坡或扩增曲线变形，如下图。

原因分析：

①人为原因：试剂分液不准确，盖八连管盖子不当造成管盖有破损，导致反应液蒸发。

②耗材原因：八连管质量不佳或没有选择配套的盖子，导致管盖不严密。

③试剂原因：试剂放置时间过长或过期。

解决方案：

①重新复检样本。

②重新配制试剂再检测。

③管盖严密，选择配套耗材，有瑕疵的耗材及时更换。

7、扩增曲线扩增不完整，如下图。

原因分析：

①人为原因：加样量不准确导致扩增效率低，配制试剂没有充分混匀或分装不均匀。

②标本原因：标本病毒量太低或标本存在抑制成分。

③仪器原因：荧光染料浓度低或仪器问题荧光收集异常。

解决方案：

①重新提取样本，排除加样量不准确导致扩增效率低。

②检查试剂是否充分混匀、分装准确，更换试剂，必要时可双试剂检测。

③检查仪器。

8、扩增曲线无典型S型扩增，呈现为斜直上飘的特点，如下图。

原因分析：

①人为原因：试剂分液不准确

②耗材原因：管盖不严密导致液体蒸发引起探针浓度增加。

解决方案：

①试剂分液要准确、均匀，上机扩增前检查八连管液面是否在同一水平线上。

②核酸加样后压紧管盖，上机扩增前再次检查管盖有无缝隙。

关于“内标曲线异常”处理思路图

在日常核酸检测工作中，每天都有可能遇到千奇百怪的扩增曲线。每一个异常曲线的出现都是有原因的，许多方面的原因都可以干扰PCR扩增曲线。作为检验人，我们遇到问题时必须要沉着冷静，逐一排查各种可能性，每个环节抽丝剥茧，做到明察秋毫，找到问题所在并持续改进，为患者出具准确可靠的核酸检测报告。