基本信息
论文题目：Exosomes released from tumor-associated macrophages transfer miRNAs that induce a Treg/Th17 cell imbalance in epithelial ovarian cancer
发表期刊：Cancer Immunology Research
发表时间：2018.11
影响因子：9.188
通讯作者：上海交大医学院 汪希鹏教授、林盈盈博士
本文涉及的高通量技术：安捷伦miRNA芯片（由欧易生物提供服务）
研究背景
免疫微环境由肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）和T淋巴细胞组成，后者包括调节性T细胞（Tregs）和T细胞助手17细胞（Th17），免疫微环境对上皮性卵巢癌（Epithelial ovarian cancer，EOC）的发展具有重要作用。Treg/Th17细胞不平衡与系统性红斑狼疮、糖尿病、肿瘤等多种疾病有关。研究发现TAMs能够产生外泌体作用于微环境中毗邻的细胞，但是EOC免疫微环境中外泌体及其转运的miRNA的具体功能和作用机制仍是未知的。
研究内容
基于TAMs细胞来源的外泌体miRNA芯片分析，作者发现了miR-29a-3p和miR-21-5p高表达。将两种类型的miRNA mimics转染到CD4+ T细胞，发现其抑制STAT3的表达，并造成Treg/Th17失衡。
结果表明，外泌体能够调节TAMs细胞和T细胞的相互作用，产生的免疫抑制性微环境能够促进EOC肿瘤细胞的生长和转移。分析TAMs细胞来源的外泌体及其相关miRNA能够为EOC新的治疗方法奠定基础。
研究思路
研究结果
1.EOC患者组织中Treg/Th17发生了上调
选取124个EOC患者和26个良性卵巢肿瘤患者的卵巢组织样本，通过免疫荧光检验发现与良性卵巢肿瘤患者相比，EOC患者的初期肿瘤组织和转移性腹膜组织Treg/Th17均显著升高。
图1 |（E）EOC组织（n=124）和良性卵巢肿瘤组织（n=26）Treg/Th17的比率对比；EOC腹膜组织（n=15）和良性腹膜组织（n=6）Treg/Th17的比率对比
2.Treg/Th17失衡对卵巢肿瘤生长和转移的影响
利用ID8细胞系构建转移性卵巢癌C57BL/6模型，体内实验发现Treg/Th17的比率升高能够促进肿瘤细胞的生长，也能够促进肿瘤细胞的转移。
图2 |（C）向C57BL/6小鼠腹腔内注射ID8-Luc-pur细胞，用荧光成像系统发现高Treg/Th17比率能够显著增加肿瘤的载量；（G）用伊红（Hematoxylin-eosin）对肿瘤细胞进行染色，实时成像后发现肿瘤细胞遍布整个腹腔
3.M2巨噬细胞产生的外泌体能够诱导Treg/Th17失衡
诱导TAM分化成M1和M2两种类型的巨噬细胞，未处理的巨噬细胞作为对照，分别与CD4+ T细胞进行共培养，发现TAMs细胞能够诱导Treg/Th17的失衡。各自分离外泌体后再次与CD4+ T细胞进行共培养，发现TAMs细胞产生的外泌体能够诱导Treg/Th17失衡。
图3 |（B）三组中Treg/Th17的比率；（F）三组巨噬细胞分离得到的外泌体分别与CD4+ T细胞共培养三天，Th17和Treg细胞的比例通过流式细胞分析确定，并计算Treg/Th17
4.外泌体miRNAs通过靶向STAT3来诱导Tregs/Th17失衡
安捷伦miRNA芯片分析发现，M2巨噬细胞分泌的外泌体中有42个miRNAs发生了上调和10个miRNAs发生了下调，其中有五个上调miRNAs和一个下调miRNAs与T细胞分化有关。将miRNA mimics转染到CD4+ T细胞，发现只有hsa-miR-29a-3p和hsa-miR-21-5p能够改变Tregs/Th17。
Western blots和RT-PCR分析发现过表达hsa-miR-29a-3p和hsa-miR-21-5p导致CD4+ T细胞的STAT3蛋白及其mRNA都发生下调。RT-PCR和流式细胞检测分析进一步发现，细胞因子IL4、IL6和TNFα下调，抗炎细胞因子TGFβ和IL10上调。以上因素造成EOC肿瘤微环境失衡，最终导致肿瘤的发展。
图4 |（A）THP-1和THP-1诱导得到的M2巨噬细胞分泌的外泌体中miRNA表达Heatmap图；（B）和T细胞分化相关的miRNA；（D）将Hsa-miR-21-5p和hsa-miR-29a-3p mimics转染到CD4+ T细胞，流式细胞检测Th17和Treg细胞的比例，并计算Treg/Th17；（E）Western blot观察Th17和Treg细胞STAT3蛋白表达量；（G）RT-PCR观察Th17和Treg细胞STAT3 mRNA的表达量；（J-K）CD4+ T细胞受到hsa-miR-21-5p和hsa-miR-29a-3p mimic转染或敲降后，Tregs细胞因子TGFβ、IL10和IL4以及Th17细胞因子TNFα和IL6的表达量
5.mmu-miR-29a-3p和mmu-miR-21-5p对卵巢肿瘤转移的影响
向小鼠腹腔注射ID8-Luc-pur细胞，再次构建转移性卵巢癌C57BL/6模型，利用生物成像系统观察肿瘤的生长情况，发现mmu-miR-21-5p-mimic和mmu-miR-29a-3p-mimic组肿瘤载量显著增加。收集小鼠的腹膜、肠系膜和膈膜，利用实时成像技术观察肿瘤的转移情况，发现mmu-miR-29a-3p和mmu-miR-21-5p能够促进肿瘤的生长和转移。
图5 |（C）向小鼠腹腔注射ID8-Luc-pur细胞，10周后利用生物成像系统检测肿瘤细胞的荧光强度（cps）；（F）10周后小鼠腹腔的成像情况
6.Treg/Th17失衡与EOC分级和患者存活率有关
利用ROC曲线比较Treg/Th17在EOC患者中的灵敏性和特异性，Treg/Th17对临床上EOC患者的总生存率具有很好的预测价值。利用TCGA数据库分析Treg/Th17和EOC患者的相互关系，得出Treg/Th17与EOC的组织学分级有关，并且是一个独立的预后指标。
图6 |（A）ROC曲线反映Treg/Th17比率在EOC患者中的灵敏性和特异性；（B）基于Treg/Th17不同比率（大于1.02和小于1.02）的EOC患者存活率情况；（C）TCGA数据库中467个EOC患者的Treg/Th17和总生存率（OS）的关系；（D）TCGA数据库中467个EOC患者miR-29a-3p和miR-21-5p表达量与OS的关系
总结
来自TAMs的外泌体向CD4+ T细胞转运hsa-miR-29a-3p和hsa-miR-21-5p，通过直接靶向STAT3，导致Treg/Th17失衡，诱导EOC肿瘤的生长和转移。
图7 | TAMs通过外泌体诱导EOC肿瘤发展的途径
参考文献
Zhou J, Li X, Wu X, et al., (2018). Exosomes released from tumor-associated macrophages transfer miRNAs that induce a Treg/Th17 cell imbalance in epithelial ovarian cancer. Cancer Immunology Research. doi: 10.1158/2326-6066.cir-17-0479
联系客服
