miRNA+二元变量=3分文章

3分文章对于许多医生晋升、博士毕业是个分水岭，其作用远远大于几篇1分的纯水文，当然发表难度也是。因此学会一些3分文章的套路对于一些医生、博士来说，是进入更高层次科研的钥匙。

今天要读的文章是一篇发表在BMC cancer（IF=3.288）上的关于miRNA-34a的二元变量的文章 "MicroRNA-34a is a tumor suppressor in choriocarcinoma via regulation of Delta-like1"。

miRNA相关文献设计一般分为以下几个步骤，即分析miRNA的表达差异情况，制备miRNA过表达或抑制的实验工具，细胞表型验证，找miRNA的靶基因。miRNA是一种抑制靶基因表达的非蛋白编码小RNA, miRNA一般通过阻遏翻译或引导mRNA降解发挥作用。

而二元变量的逻辑论证链一般分为以下几个步骤：主变量（A）调节表型，主变量（A）调节因变量（B），Rescue证明A调节表型依赖于B。

本文的主变量是miR-34a、因变量Notch通路的Delta-like1(DDL1)、疾病是绒癌，表型是增殖和迁移表型。

我们可以提出科学假设：

在绒毛膜癌的增殖和迁移表型中，miR-34a可介导Notch通路的Delta-like1(DDL1)发挥作用。

一般可以通过以下几步进行逻辑论证：

1）miR-34a可有增殖与迁移表型

2）miR-34a可靶向调节DDL1

3）miR-34a可经由DDL1调节增殖与迁移表型

结果解读

Figure 1. Effect of miR-34a on choriocarcinoma cell（细胞表型）。

通过克隆形成实验和transwell实验证明，过表达miR-34a可减少绒癌细胞株的增殖和侵袭表型。

克隆形成实验

一般依据依据采用的培养介质的不同，分为平板克隆（Colony formation）和软琼脂克隆（soft agar colony formation）两类，可通过克隆形成率反映出细胞群体依赖性和增殖能力的两个重要性状，常用于评价不同杀伤因素（药物、基因等）对肿瘤细胞增殖能力或群体依赖性的敏感性，以及癌细胞在体内成瘤性，体外克隆能力越强，则体内成瘤性越强。

transwell实验

Transwell 小室是用一层膜将低营养的培养基和高营养的培养基分开，即将处于低营养培养基中的肿瘤细胞种于上室，下室加入 FBS 或某些特定的趋化因子，肿瘤细胞向营养成分高的下室跑，计数进入下室的细胞数量可以反映肿瘤细胞的迁移能力。

Figure 2. Validation of DLL1 as a miR-34a target gene (直接机制) ，miR-34a直接抑制DLL1。

A图是miR-34a 与DLL1结合序列的预测；

B图说明miR-34a 与DLL1，Notch1 的表达相关性；

C图通过荧光素酶基因报告试验说明miR-34a可靶向调节DDL1，过表达miR-34后，lucifer 活性降低，说明miR-34a直接抑制DLL1，当DLL1结合位点突变后，lucifer活性又升高，这是位点突变的验证；

D图和E图在两个细胞株中通过qPCR说明在miR-34a作用下，DDL1、Notch1 mRNAs水平没有显著变化，说明miR-34a通过抑制转录调节DLL1的表达。

为了进一步研究miR-34a对DLL1介导的NOTCH1通路的影响，作者检测了其通路明星分子Hes-1，发现Hes1 表达显著降低。

qPCR

其原理是在 PCR 扩增过程中收集荧光信号，并转化为成为扩增和熔解曲线，以实现对 PCR 进程进行实时检测。具体数据就是基线、荧光阈值和 Ct值。

Ct 值就是荧光值达到阈值时候的PCR循环次数。Ct值跟初始模板的量成反比。第3-15个循环的荧光值就是基线（baseline），是由于测量的偶然误差引起的。阈值（threshold）一般是基线的标准偏差的 10 倍。

Figure 3. Role of DLL1 and Notch signaling in cell invasion

A图和B图通过transwell实验说明DDL1可促进细胞迁移，NCID即the intracellular domain of the Notch receptor，检索原文可在前言处得知是notch通路的一个转录因子。

C图通过柱状图说明NCID、DDL1处理后，细胞增殖无显著变化。

Figure 4. MiR-34a reduces cell invasion through Notch signaling

A，B 图的transwell 结果可得出miR-34a可减少迁移，NCID+miR-34a 可促进迁移，是Rescue的结果；miR-34a负调节Notch，回复策略“反正正”。

C图可得出miR-34a 与增殖表型的关系， 对增殖无显著影响；

D图说明通过qPCR检测得知uPA,MM9在miR-34a作用下表达降低。

Figure 5. MiR-34a inhibition enhances tumor growth in vivo。

通过SCID 小鼠模型，对比miR-34a与对照组的肿瘤的重量，大小，来反向说明miR-34a可抑制肿瘤增殖。D图 通过免疫组化说明miR-34a组 DDL1 可在肿瘤异体移植物中表达升高。

免疫组化

基于抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂 (荧光素、酶、金属离子、同位素) 显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量的研究。

小结

Notch信号通路发挥作用始于细胞膜上的Notch受体与其临近细胞上的DDL1(Delta-like1)配体结合，经过酶解过程，释放其有活性的胞内域（Notch intracellular domain,NCID）,与细胞核上的DNA结合蛋白RBP-Jk结合，形成转录因子，刺激其靶基因HES1, HES5的转录，继而调节下游靶基因,从而决定细胞的分化,并调控多种组织的生长发育。

以下图片（PMID:21716644）可供参考

本文中urokinase-type plasminogen activator (uPA) 、the matrix metalloproteinase-9 (MMP9)可视为迁移表型的标志物。

从细胞维度，通过BeWo 和 JEG-3两种细胞株进行实验，过表达miR-34a说明其与增殖、迁移的相关性，以及DDL1，Notch1 与这两种表型的关系。

Fig4可视为miR-34a与Notch1的Rescue实验。从小鼠肿瘤组织中说明mIR-34a 与DDL1的关系；从机制层面说明miR-34a 可靶向DDL1发挥作用。

本文逻辑层次清楚，尚缺乏miR-34a抑制剂作用效果与miR-34a在人肿瘤组织中表达情况的说明。