欢迎回来看应用生物材料的PCR视频系列。
在这个视频中，我们将介绍两种主要类型的qPCR，基于SYBRGreen的qPCR和基于TaqMan的qPCR。
在ABM、或者叫“应用生物材料”，我们可以满足您所有对PCR的需求。我们提供广泛的DNA聚合酶、PCR master mixes和其他PCR产品。
qPCR也被称为实时PCR或定量PCR,是一种能够扩增DNA、并和检测扩增子浓度变化的技术。
qPCR通过使用特殊探针或DNA结合染料发出的荧光信号，在扩增过程中收集数据。
多年来，qPCR已被用于许多应用。它主要用于基因表达的定量分析，验证DNA微阵列结果、和量化病毒细菌或真菌的负荷，这是我们举的少数几个例子。
在我们了解qPCR的类型之前，我们首先需要知道要使用哪些仪器（来做qPCR）。
为了使您的qPCR获得可靠和准确的结果，需要适当的仪器来提供能量和检测荧光信号。有三种常见的方法可以提供能源：灯、LED、和激光器。光电探测器用于收集数据，它仅允许我们所要的波长的光通过。
除了多出的光电探测器之外，qPCR机器非常像用于PCR扩增的常规热循环仪。
由于qPCR提供实时输出，因此需要使用特殊的计算机软件来分析其收集的数据。当收集数据时，软件显示扩增曲线，该曲线是对应于循环数绘制ΔRn的对数图。
Rn的变化量、或者叫荧光信号的变化量，是用这个公式来计算的，Rnf – RnB，其中Rnf是任何给定点发出的荧光强度，而Rnb是荧光发射强度的基线。
Ct值是给定样品的ΔRn超过阈值的PCR热循环次数。Ct值与样品中的核酸量呈负相关。例如，较低的Ct值表示靶核酸的量较高；而较高的Ct值意味着只有很少的起始材料可以被扩增。
一种类型的qPCR是基于SYBR Green的方法，它是靠嵌入性染料SYBR Green 1（的发光强度来检测DNA的量）。
SYBR Green染料发出荧光信号。当SYBR Green染料与双链DNA结合时，它（发出的荧光）被热循环仪检测到。
当下一个PCR循环开始时，双链DNA发生变性，荧光信号降低（译者注：SYBR Green染料只有与双链DNA结合，才会发出荧光）。
因此，在每个PCR循环的延伸步骤结束时，qPCR仪器检测样品的荧光信号强度。
下一代的DNA结合染料是EvaGreen染料。它提供比SYBR Green 1染料更亮的信号。
因为这种嵌入式染料的化学性质（译者注：指EvaGreen或SYBRGreen无差别地与所有的双链DNA都会结合，并发出荧光），这样用户无法在PCR循环阶段区分荧光是从靶基因的扩增片段发出，还是从非特异性的基因扩增片段发出。
熔解曲线分析帮助用户能够区分（靶基因的）扩增产物（与非特异的扩增产物），（方法是）通过绘制荧光强度作为温度的函数的图。
当DNA被加热时，热量会削弱将两个单链DNA分子固定在一起的氢键，并最终会将氢键断开。这个过程称为DNA熔化或DNA变性。
“熔化温度”或都叫“Tm”的定义是这个温度下，DNA分子处于“完全双链盘绕状态”和“完全变性解链状态”之间的中间过渡状态。
对于基于SYBR Green I或EvaGreen的qPCR反应，使用的聚合酶必须是热稳定的，而且该聚合酶还要能抵抗抑制剂，例如：Tfl酶、Pwo酶、Tth酶、或Pfu酶等DNA聚合酶。
第二种类型的qPCR（检测方法），被称为TaqMan探针方法。
这种方法利用Taq DNA聚合酶的从5’端到3’端的核酸外切酶活性。它的两端标记有一对特殊的探针。其中一端标有荧光报告染料，另一端标有荧光淬灭染料。
用这种特殊探针的目的，是防止发生结合性染料（如SYBR Green I）附着于非特异性扩增子（并发出荧光的情况）。
两种染料的接近抑制了报告基因发出荧光。这两个染料基团相互靠近，会抑制报告探针发出荧光。
Taq聚合酶具有从5’端到3’端的外切核酸酶活性，能够切割5’末端的核苷酸。当聚合酶遇到探针时，它会取代并切割报告探针的染料5’端。这使得报告染料基团能够发出荧光，因为它不再被淬灭。
探针淬灭荧光有两种机制。“荧光共振能量转移”或叫作“FRET猝灭”，和“非FRET静态猝灭”。
在FRET猝灭中，当供体荧光团被光子激发时。供体荧光基团通过偶极 -偶极相互作用将能量转移到受体荧光团。
而在非FRET静态淬灭中，报告基团和淬灭基团接近。
在qPCR中，如果两个荧光基团都发出荧光，则数据将变得难以解释。因此，淬灭染料基团和TaqMan探针通常是暗的，并且它们自身不会发出荧光。
报告基团和淬灭基团之间的物理相互作用使报告基团处于基态。这将会淬灭报告基团的荧光。
在TaqMan探针中常用几种不同类型的报告染料基因，例如：FAM、TET、和JOE。并且有几种不同类型的淬灭剂染料，例如TAMRA、BHQ、和MGB。
当选择与报告染料配对的淬灭剂染料时，必须同时考虑FRET淬灭和非FRET静态淬火。在FRET淬灭中，重要的是报道分子的发射光谱与淬灭剂的吸收光谱重叠。在非FRET静态淬火中，染料的结构更为重要。
SYBR Green方法和TaqMan方法之间的主要区别之一，就是是否在反应中使用特殊的可水解探针。
TaqMan方法中的特殊探针仅与特定的靶扩增子退火。这能降低PCR中非特异性的、和污染性的扩增产物，被当作为目标扩增产物的可能性。
通过在不同的水解探针中插入不同的荧光基团（译者注：不同的荧光基团会发出不同的荧光颜色），可以通过热循环仪检测不同（颜色）的报告信号。这样，用户就能在单个反应中同时监测不同的扩增子，这一过程称为“多重反应”。
SYBR Green方法更容易获得，并且更便宜。然而，SYBR的缺点是荧光染料可以与靶扩增子和其他非特异性序列结合。因此无法从扩增曲线中正确区分荧光（信号是来自于目标的特异扩增子，还是来自于非特异的扩增子）。
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