前 言
单细胞转录组测序一个非常重要的研究方向就是单细胞分辨率下重新定义细胞类型，挖掘得到新的细胞亚群和marker基因。今天为大家解读一篇单细胞转录组测序在视网膜神经节细胞中的应用案例，该文章通过10 × Genomics单细胞转录组测序获得了六万多个神经节细胞的表达谱，聚类得到了40个神经节细胞亚群，探讨了神经节细胞亚群的功能、发育进程以及鉴定了神经节视网膜细胞的marker基因。
基本信息
材料：小鼠视网膜
方法：10× Genomics单细胞转录组测序
期刊：nature communication
影响因子：12.353
研究目的
重新定义视网膜神经节细胞类型及鉴定对应的marker基因
实验流程与技术路线
图1 | 实验流程示意图
取出生后5天的小鼠左眼和右眼的视网膜，解离成单细胞悬液后进行免疫抗体包被筛选（Immunopanning），筛选得到视网膜神经节细胞（retinal ganglion cells，RGCs）。
图2 | 技术框线示意图
研究内容
1. 鉴定神经节细胞亚群
图3 | 鉴定神经节细胞亚群
通过聚类分析将6,225个RGCs分为了40个亚群（Fig 3.d），这些RGCs均表达视网膜神经节细胞的marker基因Thy1，与前期免疫抗体包被筛选结果一致。整体看这40个cluster的基因表达谱都比较相似，任意簇与簇之间的相关系数均大于0.9（r ＞ 0.9, Pearson）（Fig 3.f和Fig 3.g）。
2. RGCs在左右眼球分布的偏重分析
图4 | 左眼和右眼中RGCs的分布特征分析
因为RGCs的来源不同（左眼和右眼），作者想要了解左眼和右眼的RGCs是否存在分布以及表达上的差异性。作者发现大部分cluster中左右眼球的RGCs占比相似以及表达谱相似（Fig 4.a、Fig 4.b和Fig 4.c）。然而，作者发现尽管cluster 40细胞总数比较少，但是这个cluster的细胞主要是右眼中的细胞，左眼中非常少。说明cluster 40所代表的视网膜神经节细胞功能可能在右眼中起到一个支配性的作用。
3. 亚群功能挖掘及marker基因鉴定
图5 | cluster基因表达特征分析
比较了左右眼球RGC中的不同之后，作者主要从三个方面进行比较不同的cluster，即：1. 表达的基因数量；2. 基因的表达量；3.cluster的细胞数量。结果发现culster 1和culster 13这两个亚群是细胞数目最多的两个亚群，但是基因的表达数目和表达量反而是最低的。一般来说，细胞的体积越大，它的转录可能越活跃，这里作者发现culster 1和culster 13虽然细胞数目上比重较大，但是基因表达较低，因此作者推测这两个culster可能是微型视网膜神经节细胞。
图6 | marker基因鉴定及原位杂交验证
下一步，作者鉴定了各亚群的marker基因，并通过免疫荧光原位杂交验证出Runx1和Fst分别可以作为cluster 27和cluster 3的marker（Fig 6）。对40个cluster构建系统发育树，作者将40个cluster分为10类，这10类还可以进一步聚成4类（Fig 7）。这样的聚类结果，也可能代表着视网膜神经节细胞的发育过程，即先分化为4类，再分化成10类，最后进一步分化行成40种神经节视网膜细胞。
图7 | RGCs构建系统发育树结果展示
4. 轴突再生调节基因表达分析
图8 | 轴突再生调节基因表达热图
临床轴突再生治疗过程中，不同视网膜神经节细胞的轴突再生修复能力区别较大，作者想要知道某些cluster是否富集了提高轴突生长能力的基因或者是抑制轴突生长能力的基因。结果发现不同cludter间轴突再生调节基因表达差异较大（Fig 7）。在这些轴突再生调节基因中作者对KLP9非常感兴趣，因为前期的研究结果发现某些RGCs沉默KLP9可以促进轴突再生，而这里作者通过单细胞测序直观的确定了anti-KLP9 shRNA的作用靶标细胞为cluster 7、cluster 20、cluster 27以及cluster 34。
参考文献
Rheaume B A, Jereen A, Bolisetty M, et al. Single cell transcriptome profiling of retinal ganglion cells identifies cellular subtypes[J]. Nature communications, 2018, 9(1): 2759.
DOI: 10.1038/s41467-018-05134-3.
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