在人类基因组计划之后，RNA干扰(RNAi)和CRISPR-Cas这两种改变基因表达和研究基因功能的方法已经出现在科学发现的前沿。
虽然最初是RNAi主导了基于研究的应用，但基于CRISPR-Cas的方法近年来有了显著的增长。这两种策略具有非常具体的优点和局限性，并且它们在许多应用中相互补充。二者均能填补生物医学研究和药物发现的特定领域。
“我看到了许多使用RNAi技术治疗各种患者疾病的机会，”麻省理工学院(MIT)生物学教授、1993年诺贝尔生理学或医学奖得主Phillip A. Sharp博士说道。
1993年诺贝尔生理学或医学奖得主Phillip A. Sharp博士（图片来源于麻省理工学院Sharp实验室官网）
2018年8月，FDA批准了首个RNAi疗法，用于治疗遗传性转甲状腺素蛋白淀粉样变性(一种进行性多神经病)。Dr. Sharp表示：“这让人们越来越相信，将RNA引入细胞，并利用一种小RNA激活的细胞机制，可能对治疗有益。”
RNAi作为一种调节细胞内蛋白质水平的研究工具，与其他将外源性物质递送到细胞的策略相比具有明显优势。其中之一是RNA本身不像蛋白质那样具有免疫原性。同时，RNAi提出了与其他基因组工程方法不同的具体挑战。
内源性RBPs的交互作用
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Dr. Sharp表示：“我们知道3种类型的脱靶活性，这是十年前就知道的。”先天免疫反应的激活就是其中之一。夏普博士补充道：“只要选择适当的RNA序列，并对所使用的siRNA进行修饰，这似乎是可以做到的。”
另一种脱靶效应源于microRNAs (miRNAs)与多种不同信使RNA (mRNA)分子的相互作用。
第三个效应是，当选择了选择性干扰RNA (siRNA)时，其种子区域极有可能与RNA结合蛋白(RBP)的结合位点重叠。因此，RBP可能会潜在的竞争该位点，或者通过排除该蛋白质的结合来调节RNA的信息活性。
“这些通常是比较保守的位点，”Dr. Sharp指出。“通过筛选多个可能的靶标，可以避免这种效应。”
在最近的一项研究中，Dr. Sharp研究了已发表的微阵列数据集，并进行了大规模的RNAi致死率筛选，以寻找siRNA和miRNA中RBPs和种子序列之间的交互作用、它们对RNAi的影响，以及解释RNAi脱靶表型的意义。
“我们通过对少数患者的遗传性疾病分析来得出这一结论，”Dr. Sharp表示。在这种情况下，与超级增强子相关的保守miRNA中的突变导致人类骨骼疾病，并在高度表达的RNA和RBP的结合基序之间产生重叠。结果，突变的miRNA与RBP竞争并干扰其细胞活性。 当在小鼠中引入相同的突变时，会导致功能获得性表型。“基于这些观察，我们开始考虑RNA结合蛋白和siRNAs之间可能的相互作用，”Dr. Sharp回忆道。
Dr. Sharp实验室的研究结果支持一种称为“内源性RBPs交互作用”的模型，即如果siRNA和miRNA的种子序列与RBP结合基序具有重叠，就可能干扰RBPs的活性。该模型揭示了miRNA调控复杂性的一个新层面，对RNAi和功能基因组学研究的设计和解释具有重要意义，包括通过不使用种子序列与RBP结合基序重叠的miRNAs或shRNAs（小发夹RNAs）来避免脱靶效应的潜力。
球形核酸
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“我们正在使用一种基于纳米技术的平台，能够稳定地将siRNA或miRNA寡核苷酸递送到颅内脑肿瘤中，”美国西北大学神经学副教授Alexander H. Stegh博士说。
美国西北大学神经学副教授Alexander H. Stegh博士（图片来源于美国西北大学Alexander Stegh实验室官网）
为了将siRNAs注入恶性肿瘤，Dr. Stegh实验室的研究人员与国际纳米技术研究所所长Chad Mirkin博士、西北大学化学教授George B. Rathmann合作开发了球形核酸(spherical nucleic acids, SNAs)，其中金纳米颗粒核心被径向导向的寡核苷酸壳密集地功能化。
SNAs在体外可以穿透细胞系，并且它们在动物体内通过全身给药后可穿过血脑屏障，引发其靶基因的强烈下调，并降低致瘤性。通过使用这些颗粒，Dr. Stegh将基因调控寡核苷酸系统地递送给携带颅内肿瘤的动物，并证明它们可以纠正某些遗传缺陷。当siRNAs靶向脑癌癌基因时，它们的表达被下调，导致胶质瘤细胞在体外和体内的细胞死亡增加。“接下来，我们的想法是将这种策略与细胞毒性疗法相结合，使肿瘤对放射和/或替莫唑胺敏感，”Dr. Stegh说道。
SNAs的模块化允许独立控制颗粒大小、形状和表面化学，为创建不同结构和功能提供了可能性。在比较通过球形核酸和脂质复合物递送相同siRNA以进行脱靶效应的研究中，Dr. Stegh发现，脂质复合物递送的siRNA寡核苷酸导致数百个基因发生变化，但通过SNAs递送相同的siRNA 仅有少数基因发生变化。Dr. Stegh承认“暂时还并不完全理解为什么纳米颗粒核心中的siRNA导致的脱靶效应比脂质体复合物要小，但只要使用金纳米颗粒递送siRNA时，脱靶效应似乎就会有所降低。'
球形核酸（spherical nucleic acid, SNA）是由美国西北大学的科学家设计的一种纳米医学模式，其核心是一个金颗粒，并从核心辐射出一系列siRNA或miRNA寡核苷酸。
与传统药物开发相比，纳米技术领域的颗粒优化工作相对有限。“在接下来的几年里，我们的目标应该是建立一个更加强大的优化过程，以便提出合理的问题，例如核心材料、核心形状和大小，以及SNA表面化学的其他方面，如何影响结构的整体活性，“Dr. Stegh说。另一个挑战源于需要开发更强大且更具体地将siRNA或miRNA递送到肿瘤中的策略。“通过我们的颗粒，当我们进行全身给药时，高达98％的颗粒在肝脏、脾脏和肾脏中，并且只有一小部分会进入它们应该去的癌症中，”Dr. Stegh说。
另一个挑战是纳米药物被受体介导的内吞过程所吸收，因此它们常常被包裹在核内体中。 “我们正在研究优化内体逃逸的策略，并提供更高程度的细胞质可用性和更多的RISC参与，” Dr. Stegh告诉我们。“这是该领域的一个主要研究方向。”
RNAi仍导致组织特异性和条件沉默
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“基因组编辑正在蓬勃发展，这为RNAi带来了一些挑战，但RNAi仍然具有其价值，”密苏里大学植物科学系研究教授Zhanyuan J. Zhang博士说。 Dr. Zhang团队关注的研究领域之一是利用基因沉默和基因组编辑来改善种子性状。“通过基因组编辑，有条件地或以组织特异性的方式沉默基因是比较困难的，这是RNAi仍然有其优点的一个应用，” Dr. Zhang坚持道。
美国密苏里大学植物科学系研究教授Zhanyuan J. Zhang博士（图片来源于密苏里大学官网）
在一项改善发夹RNA诱导的大豆RNAi的研究中，Dr. Zhang团队对FAD3基因家族的三个活性成员进行了沉默，发现尽管沉默程度显著，不同RNAi株系之间亚麻脂肪酸的下调也存在差异。在这项工作的基础上，Dr. Zhang团队发现，转基因转录本水平的变化可以通过不同水平的转基因DNA甲基化和转基因反向重复序列与靶转录本之间的序列同源性来解释。
RNA介导的农作物基因沉默机制是密苏里大学植物科学系研究人员感兴趣的课题。 例如，研究人员利用siRNA来沉默大豆基因组中负责产生亚麻酸的基因，亚麻酸缺乏氧化稳定性并破坏籽油的味道。在这项工作中，研究人员发现RNAi帮助他们处理大豆基因组的高度重复区域和许多基因家族。
“与其他一些分析相比，RNAi和转录组分析速度更快，成本更低，但结论不那么明确，所以这是这些技术的局限性，” Dr. Zhang指出。提高RNAi价值的一种策略是将其与其他方法的应用结合起来，作为基因表达研究的一部分。“蛋白质组学和RNAi应相互补充，并与代谢组学互补，”Dr. Zhang总结道。
CRISPR-Cas13争夺一个关键角色
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“RNAi的最大问题在于它依赖于人体细胞内的内源性miRNA系统进行敲降，”罗切斯特大学医学中心生物化学与生物物理学助理教授Mitchell R. O'Connell博士说。虽然RNAi通常能成功导致RNA的敲降，但在人类细胞中，一个关键的挑战是，RNAi主要由内源性miRNA通路介导，部分互补性足以达到敲降的效果。
罗切斯特大学医学中心Mitchell R. O'Connell博士（图片来源于罗切斯特大学医学中心O'Connell实验室官网）
“当一个siRNA或shRNA被引入来敲除一个特定的RNA转录本时，它被设计成与该转录本具有完全的互补性，但自然也会与许多其他基因具有部分互补性——这实际上很难绕开这个问题。在某些情况下，它会导致显著的脱靶效应，”Dr. O’Connell解释道。
最近比较基因靶向方法的研究表明，RNAi与CRISPR-Cas13相比，具有显著更多的脱靶效应。“Cas13似乎比RNAi更具特异性，可能成为降低RNA水平、调节蛋白质表达的首选工具，”Dr. O’Connell说道。CRISPR-Cas系统的一个关键方面是需要设计guide RNAs (gRNAs)和具有高靶向效率和低靶向命中潜力的靶点。“我们希望看到RNA靶向领域使用与DNA基因编辑领域类似的方法，包括在线算法和资源，让这些工具为科学界所用，”Dr. O’Connell说道。
在最近的一项研究中，Dr. O’Connell团队使用测序和生物化学实验来检查错配对Cas13a RNA结合和核酸酶活性的影响。这项工作表明，这两个活性是不相关的，并且受到guide RNA和靶标之间错配数量和位置的不同影响。例如，CRISPR-RNA种子区域中间的错配导致了最大的结合亲和力和核酸酶活性缺陷，而在其他位点的错配，即使它们的结合减弱，也能够最大程度地激活核酸酶活性。这些发现有助于更好地理解Cas13a在细菌免疫中的作用，以及提高RNA靶向的保真度。“还有一些障碍需要克服，这个系统需要进行优化，直到每个人都能轻松使用为止，”Dr. O’Connell表示，“但我们希望能够实现这一目标。”
文章来源于：
https://www.genengnews.com/magazine/november-15-2018-vol-38-no-20/rnai-shares-discovery-spotlight-with-crispr-cas/
参考文献：
[1] Suzuki H I, Spengler R M, Grigelioniene G, et al. Deconvolution of seed and RNA-binding protein crosstalk in RNAi-based functional genomics[J]. Nature genetics, 2018, 50(5): 657.
[2] Tambe A, East-Seletsky A, Knott G J, et al. RNA binding and HEPN nuclease activation are decoupled in CRISPR-Cas13a[J]. Cell Reports, 2018: 190603.
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