随着测序价格下降，肿瘤基因组学研究的深入，单从传统的取样模式进行队列研究，已经很难在原来的基础上有更具创新的发现。以往的肿瘤基因组学研究已经较为全面地揭示了肿瘤发生发展过程中的突变如SNV、CNV、SV等，和其所影响的生物学通路，但在解释肿瘤发生机制和肿瘤治疗方面并没有提供太大帮助，原因在于肿瘤存在异质性，克隆进化分析是研究肿瘤异质性的一个强有力手段，通过研究区分肿瘤进化过程里中的早期突变（主克隆 ）和晚期突变（亚克隆），构建该肿瘤的突变进化历史，能够很好地解释肿瘤的发生转移机制，从而给该肿瘤靶向治疗药物的开发提供基础。
文章题目：Tracking the evolution of non–small-cell lung cancer
研究人员：英国弗朗西斯·克里克研究所Charles Swanton教授领导的研究团队
发表时间：2017.04
期刊名称：NEJM
影响因子：72.406随着测序价格下降，肿瘤基因组学研究的深入，单从传统的取样模式进行队列研究，已经很难在原来的基础上有更具创新的发现。以往的肿瘤基因组学研究已经较为全面地揭示了肿瘤发生发展过程中的突变如SNV、CNV、SV等，和其所影响的生物学通路，但在解释肿瘤发生机制和肿瘤治疗方面并没有提供太大帮助，原因在于肿瘤存在异质性，克隆进化分析是研究肿瘤异质性的一个强有力手段，通过研究区分肿瘤进化过程里中的早期突变（主克隆 ）和晚期突变（亚克隆），构建该肿瘤的突变进化历史，能够很好地解释肿瘤的发生转移机制，从而给该肿瘤靶向治疗药物的开发提供基础。
样本选择：每个病人取3-4块不同样本，每块样本大概3x3x3mm，每块之间间隔0.3cm~1cm。本研究从100个非小细胞肺癌病人中挑选了327块肿瘤样本和100个正常样本进行平均深度为426x的外显子测序（图1）。
图1 取样位置
分析方法：
利用SNP频率检测避免病人之间样本交换
来自于同一个病人的所有肿瘤区域样本和对应正常的样本在除去体细胞突变之后，应该具有高度的snp相似性，通过选取之前Pengelly et al鉴定的24个SNP位点的等位基因变异频率来避免样本的错误交换。
突变检测
Bwa mem 比对，Picard 处理原始比对数据。
Samtools mpileup去除测序质量或比对质量小于20的reads
VarScan2 检测突变
支持reads数在10条以上
突变频率(VAF)在1%以上
肿瘤纯度在50%以上的“high confidence”突变挑选进入下轮分析
同时用Mutect进行突变检测用于验证降低假阳性
VAF >= 2%, VarScan2“p-value < 0.01”和mutect="">
VAF >= 5%, VarScan2 “p-value <=>
测序深度>=30,支持reads>=5
正常组织突变 支持reads<5 和vaf=""><>
独立验证降低snp污染
计算突变在所用样本中的群体突变频谱
群体频率>1%的snv去除
样本>5%的snv若在其他病人中认定是snp，则去除所有被认定为snp的snv
去除来自于UCSC Genome Table Broser关于简单重复，片段复制和微卫星区域的snv
Indels用以上同样的方法进行过滤
>=10 支持reads, p-value <= 0.001,="">=50的测序深度
driver 突变识别
从COSMIC数据库肿瘤基因谱中提取q < 0.05的基因列表，加上以往非小细胞肺癌大规模测序研究中的基因构建driver="">
通过Sift, Polyphen, MutationTaster三种预测变异是否有害的算法，来识别driver 突变。
拷贝数变异分析
Varscan2，最低深度8，最小长度50。
LogR Ratio GC矫正。
去除低质量snp。即在至少20个样本中，在0.1-0.32或者0.68-0.9的BAF频率高于<0.1或>0.9 乘以0.13469的snp。
ASCAT处理Log R 和BAF，得到allele-specific copy number data和纯度信息。
克隆分析
snv和cnv以上所有的突变用PyClone进行分类为主克隆或亚克隆，不能进行分析的若出现在病人所有测序区域的则为主克隆，其余为亚克隆。
对于病人所有区域均出现一个染色体臂的75%以上扩增或丢失，则识别为主克隆染色体臂变化。
根据突变所在的拷贝数来确定突变时间，若>1为早期，小于1则为晚期。所以突变将被分为五类，早期主克隆，早期亚克隆，晚期主克隆，晚期亚克隆。对于不能确定突变时间的，则为clonal untimed。
计算cnv片段上的突变拷贝数增加比例，若是大部分为1，则意味着突变发生在拷贝数变化之前，则这个片段为晚期。若是大部分很低小于1，则意味着突变发生在之后，则这个片段为早期。对于突变不足小于5的区域，则定义为clonal untimed。
计算cnv片段上的突变拷贝数减少比例，这里只考虑全基因组扩增情况。若是出现LOH片段，则为早期。没有出现LOH，则为晚期。而不是全基因扩增情况的则为clonal untimed。
识别拷贝丢失导致的亚克隆突变。
确定各cluster group的中位数CCF，只考虑<>
使用one-sided Wilcoxon test 或one-sided Cochrane Armitage trend test，regression analysis来确定该亚克隆突变是否跟拷贝数丢失有关。
若是85%以上的group突变跟拷贝数丢失有关，则这个亚克隆group就是拷贝数丢失导致的。
为避免过度估计，只考虑在病人75%以上区域出现拷贝数丢失的情况。
进化历史树构建
使用CITUP软件。
> 2 区域，>2突变cluster
Pigeonhole原则。一个区域的两个突变cluster的ccf相加若是超过100%，则一定不会互为独立分支进化，且相对较低ccf的cluster是较高的cluster进化而来。
为确保准确性。只有超过5个突变的cluster才考虑。
结果
基因组异质性。染色体高不稳定性与差预后显著相关（图2）。
图2 基因组异质性，染色体高不稳定性与差预后显著相关
观察到非小细胞肺癌存在广泛的异质性，平均30%（0.5-0.93）的体细胞突变和48%（0.3-0.88）的拷贝数变化为亚克隆。表明在肿瘤发展中，基因组不稳定性导致突变和染色体水平的改变是很重要的一个因素。
观察到若是只单独考虑一个区域，多区域发现75%的亚克隆突变将会被识别为主克隆突变，揭示了肿瘤存在亚克隆选择进化。
观察到细胞腺癌和鳞癌在亚克隆的数目和比例方面并没有显著差异，鳞癌的异质性跟临床特征并无显著关联，而在腺癌中，肿瘤TNM分级跟亚克隆突变的比例和亚克隆拷贝数比例正相关，Ki67染色也跟突变负荷正相关，同时具有吸烟历史的腺癌病人的亚克隆突变和主克隆突变负荷均显著高于未有吸烟历史的人。
观察到亚克隆突变比例跟肿瘤复发并无显著相关，但是高亚克隆拷贝数比例与差预后显著相关，多因素分析矫正依然显著，而从拷贝数影响的基因组范围来看跟预后并不相关，表明动态的染色体不稳定性相比基因组状态，更适合做为一个临床的预后指标（hazard ratio, 4.9; P=4.4×10−4）。
等位基因镜像不平衡分析（图3）。
图3 等位基因镜像不平衡分析
分析多个区域的同位点亚克隆拷贝数变化，推断62%的肿瘤病人存在染色体不稳定性介导的肿瘤平行进化模型，从而也可能导致13%的亚克隆突变，可能是肿瘤异质性的启动点。
76%的病人存在基因组复制事件，且大部分为主克隆，表明是非小细胞肺癌的一个早期事件。同时在腺癌中观察到基因组复制事件跟突变和拷贝数变化的亚克隆比例存在显著相关性。
非小细胞肺癌肿瘤进化历史（图4）。
图4 非小细胞肺癌肿瘤进化历史
揭示特定基因和特定拷贝数变化在肿瘤发生发展中的作用。
既是主克隆同时也大多发生在基因组复制之前表明该突变在肿瘤进化过程中的启动作用。如腺癌中的EGFR/MET/BARF突变或扩增, TERT 扩增/8p 丢失/5p 扩增；鳞癌中的NOTCH1 突变, FGFR1扩增，3p/4p/5q/17p丢失等。
主克隆但是大都发生在基因组复制之后表明起到维持肿瘤稳定或者进化作用。如腺癌中KMT2C/COL5A2突变，鳞癌中PIK3CA突变。
跟染色质修饰和DNA损伤修复应答和修复相关的基因更倾向于发生在肿瘤进化过程中的后期。如NF1/NOTCH1/3p/13q/MLH1／KRAS。
基因组复制和动态染色体不稳定性跟肿瘤异质性有关，且导致了拷贝数变化的平行进化，如CDK4/FOXA1/BCL11A扩增。
以上就是整个非小细胞肺癌多区域测序的分析方法和研究结果，同时也有采用类似方法从液态活检ctDNA层面来研究构建肿瘤进化历史。相对于单次取样容易低估亚克隆高估主克隆存在偏向性，单细胞取样的昂贵价格和较高的测序错误率，多区域测序在目前来说是一个研究肿瘤克隆结构和构建进化历史的经济可行方法。能够在一定程度上揭示肿瘤进化过程中突变分属的不同角色，或起始引发或维持或促进肿瘤恶化复发转移，给肿瘤的药物治疗提供一个精准的开发方向。
参考文献：
[1]. Jamal-Hanjani M, Wilson G A, McGranahan N, et al. Tracking the evolution of non–small-cell lung cancer[J]. New England Journal of Medicine, 2017, 376(22): 2109-2121.
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