美国达纳-法伯癌症研究所的研究团队将一种针对多个个性化肿瘤新抗原的癌症疫苗应用于临床试验。研究发现该疫苗安全性良好，且能在患者体内引起针对新抗原的免疫应答，以靶向性的方式对抗肿瘤。该论文与我们上期解读的论文（个性化RNA疫苗：唤醒人体内的抗癌武器）同期在Nature发表。
文章题目：An immunogenic personal neoantigen vaccine for patients with melanoma
研究团队： Department of Medical Oncology, Dana-Farber Cancer Institute
发表时间：2017.07
期刊名称：Nature
影响因子：40.137
研究背景
肿瘤新抗原是一类由肿瘤特异性突变所产生的，且能与HLA结合的短肽段。有效的抗肿瘤免疫与作用于肿瘤新抗原的T细胞的存在密切相关，这些T细胞不存在于正常组织内，避免了中枢胸腺耐受，因此是高度免疫性的。虽然肿瘤新抗原一直被认为是抗肿瘤免疫响应的最佳靶标，但只在最近大规模并行测序检测肿瘤组织中所有编码区突变，及机器学习预测与自体HLA高亲和力结合的突变肽段等技术的发展下，该方法才变得可行。
研究对象和方法
1.研究对象：
10名黑色素瘤病人用于全外显子测序和RNA-seq测序
6名患者注射疫苗，其中4名IIIB/C期，2名IVM1a/b期（肺转移）
2.测序方法：
全外显子测序
RNA-seq测序
RNA-seq单细胞测序
3.试验方法：
干扰素-γ酶联免疫斑点实验（ELISPOT）
细胞内细胞因子染色
流式细胞术
4.研究方法：
NetMHCpan软件
研究内容
为了生成个性化新抗原的疫苗，研究人员用全外显子测序技术对成对的肿瘤和正常细胞进行测序分析，鉴定体细胞突变。用RNA-seq表达数据对肿瘤中突变基因进行筛选，然后用NetMHCpan软件预测哪些突变多肽是最有可能结合自身的HLA-A或者HLA-B蛋白。利用预测结果生成临床等级的长肽，每个病人产生20个新抗原，与Toll样受体3(TLR3)和黑色素瘤变异相关蛋白5(MDA-5)激动剂poly-ICLC混合。在先前未经过治疗的高危黑色素瘤病人(IIIB/C期和 IVM1a/b期)经过手术切除后的临床一期研究中评估疫苗的效应。
1.疫苗的制备与接种
研究者通过对10名患者的肿瘤组织以及对照组织进行全外显子测序，得到体细胞突变，同时通过RNASEQ测序方法验证体细胞突变的表达情况。然后用NetMHCpan软件预测突变序列中能结合到MHC I类分子的表位，在筛选的过程中优先筛选致癌基因突变的，然后按照突变肽段与MHC I类分子结合的亲和力大小进行筛选。在10个检测的病人中，有8个病人在黑色素瘤中具有较高的突变率，携带了一些与黑色素瘤相关的基因，其主要突变类型为C-T转换（与紫外线暴露的结果相一致），表达多个黑色素瘤相关的marker。对于这8名患者合成13-20条长度为15-30个氨基酸的免疫长肽段（IMP），并分为4种免疫池。其中6位病人开始接种疫苗，每个病人完成了5次初种、2次加强的全过程。治疗相关的不良事件包括轻度流感样症状，注射部位反应， 皮疹以及疲劳等。
2.临床I期结果
在接种疫苗后进行了平均25个月的随访，4个IIIB/C期病人没有复发现象，2个IIIB/C期病人（肺转移）在最后一次接种后均有复发现象，随后，对复发的两个病人用抗PD1抗体药物派姆单抗（pembrolizumab）进行治疗，经过4个疗程后均获得了完全的影像学响应（注：派姆单抗在转移黑色素瘤中作为一线治疗的影像学响应率为6.1%）
图1：高危黑色素瘤病人生成个性化疫苗以及注射后的临床反应
3.疫苗接种后诱导的CD4+和CD8+T细胞应答
合成试验肽（ASP）和表位肽（EPT）用于分析免疫监测的抗原形式。试验肽覆盖了整个免疫肽肽段，由15-16个氨基酸组成，每个肽段之间至少重叠11个氨基酸，表位肽由9-10个氨基酸组成，将试验肽和表位肽进一步合并并匹配到对应的IMP肽池。通过离体干扰素-γ酶联免疫斑点实验（ELISPOT），在多个ASP肽池(3/4)中观察到外周血单核细胞(PBMC)反应，说明6个病人均对多个预测表位产生强烈的反应。通过胞内细胞因子染色法（ICS），发现大多数PBMC对肽池的离体IFN-γ-阳性反应都是由CD4+ T细胞引起的。
虽然新抗原的CD8+T细胞的响应不能直接通过离体IFN-γ酶联免疫斑点法或胞内细胞因子染色法直接检测到，但是通过对PBMC进行体外预刺激之后，在6个病人的8个EPT肽池中（一个患者至少一个肽池）中检测到IFN-γ分泌物。在接种前收集的预刺激样本中，对这些EPT肽池不存在响应，说明是在接种后产生了新的CD8+ T细胞响应。对所有的病人来说，新抗原反应产生的30%的CD4+和 CD8+T细胞都是多功能的，一般都有2-3种炎症性细胞因子的分泌物。
图2：高危黑素瘤患者在接种疫苗后诱导了强大的多功能CD4 +和CD8 + T细胞应答
为了验证是哪些预测的表位刺激T细胞反应，研究人员运用去卷积法对离体和预刺激ELISPOT实验的肽池进行分析，结果发现CD8+T细胞对其中15个免疫肽产生的表位肽存在响应，CD4+T细胞对离体试验中19个免疫肽对应的试验肽存在响应，在预刺激试验中，CD4+T细胞对39个免疫肽存在响应。通过对突变型肽段和对应的野生型肽段进行比较，发现T细胞会优先对突变的肽段进行反应。对于一些预测表位，T细胞群体在很低的浓度下依然存在反应，这或许可以用于识别肽段-MHC复合物较少的肿瘤细胞，上述这些数据表明了肿瘤新抗原相较于对应的野生型抗原具有较高的特异性。
图3：疫苗诱导的T细胞可以区分野生型和突变型的抗原；检测内源性加工和呈递的肽段
研究人员用了多种方法证明实验中检测到的T细胞反应是指向内源性处理和呈递的新抗原，发现新抗原反应的CD4+T细胞和CD8+T细胞系的自体抗原呈递细胞表达包含突变位点的25肽的串联微基因，对野生型和突变型编码微基因有不同反应的CD8+T细胞系，不能识别突变型和野生型的肽段，说明内源性加工在野生型和突变型的肽段中是不同的。
为了分析疫苗诱导的CD4+T细胞的频率与表型，研究人员生成了HLA II型四聚体用来检测对新抗原反应的CD4+T细胞，在第16周检测到RUSC2（患者1）和ARHGAP29（患者4）反应的T细胞，占所有循环CD4 + T细胞的约0.03-0.06％，其中ARHGAP29反应细胞在24周时持续存在。为了表征这些细胞的功能状态，研究者通过RNA-seq单细胞测序法对接种前的CD4+T细胞和接种后四聚体阳性的CD4+T细胞的表达量进行分析，聚类情况显示接种前和接种后的T细胞存在强烈的分离情况，数百个基因在接种后表达量发生了改变。基因表达的主要变化反映了从初始T细胞到效应T细胞和记忆T细胞的转变。
患者2和患者6在经过派姆单抗治疗后均获得了完全的影像学响应，研究者收集了经过抗PD-1治疗9-12个月的样本通过IFN-γ ELISPOT试验检测对于ASP和EPT的响应。对于病人2和病人6来说，CD4+T细胞分别对25个(4个新的)和15个(2个新的)ASP存在响应，CD8+分别对2个和4个EPT存在响应。发现在经过检查点阻断治疗后，随着时间的变化，疫苗诱导的新抗原反应持续存在，新抗原特异性T细胞也有所增多。
图4：疫苗诱导的T细胞在其转录过程中的广泛转变；新抗原特异性T细胞在PD-1阻断后仍然存在并有所增加
总结
研究人员通过一系列临床研究以及免疫应答检测，证明了个人肿瘤新抗原疫苗是安全可行的，并且能够在临床环境中引起强烈的T细胞反应，且不受以前或者正在进行的治疗的影响。使用新抗原疫苗有助于解决肿瘤免疫领域两个主要的挑战：靶向高度异质的肿瘤，以及准确靶向肿瘤而非健康组织。未来的新抗原疫苗将利用改进的预测抗原呈递的方法来增加新抗原诱导的反应T细胞，以及研究与检查点阻断和其他免疫治疗剂之间的协同作用。
参考文献：
[1] , et al. [J]. Nature, 2017, 547: 217-221.
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