TCGA的研究人员阐述了228个原发性宫颈癌病例的基因组及分子特征。他们观察到显著的APOBEC突变模式并确定了数个新的宫颈癌显著突变基因。研究还观察到CD274基因（PD-L1）、PDCD1LG2基因（PD-L2）及BCAR4 lncRNA（拉帕替尼靶点）的扩增。研究人员发现了一组HPV阴性的子宫内膜样宫颈癌，确认了并不是所有的宫颈癌都与HPV感染相关。整合聚类分析178个样本，确定了3个宫颈癌亚组：低角蛋白鳞癌亚组、高角蛋白鳞癌亚组和腺癌富集亚组，及亚组之间的差异。这些分子分析揭示了宫颈癌新的潜在治疗靶点。
文章题目：Integrated genomic and molecular characterization of cervical cancer
研究人员：TCGA
发表时间：2017/03/16
期刊名称：Nature
影响因子：40.137研究背景
全球每年有超过50万新发宫颈癌病例和25多万宫颈癌死亡病例。约95%的宫颈癌是由人乳头状瘤病毒（HPV）持续感染引起的。虽然大部分HPV感染可以在几个月内被清除，但某些HPV基因会持续表达并使抑癌基因p53和RB失活，从而导致基因组不稳定性增加及体细胞突变的积累。除此之外，在某些情况下HPV还会整合到宿主基因组中。目前，宫颈癌临床患者相关亚组尚未确定，致癌风险与组织学亚型的关系因HPV类型不同会有很大的差别，导致这些差别的原因也尚不明确。
样本选择
从未接受化疗或放疗的228位宫颈癌患者体内获取冷冻肿瘤组织（Primary frozen tumour tissue）和血液。
研究内容
1.体细胞基因组的变异：
①对192位宫颈癌患者的肿瘤及血液样本进行全外显子测序
所有样本具有至少32Mbp的目标外显子，肿瘤样本测序平均深度为49x，普通样本测序平均深度为47x。测序得出样本中包含43324个体细胞突变，包括24551个错义突变，2470个无义突变，9260个沉默突变。
②通过MutSig2CV算法发现了14个显著突变基因（SMGs），并将SHKBP1, ERBB3, CASP8, HLA-A 和 TGFBR2确定为宫颈癌的新的SMGs。
结果：检测到PIK3CA, EP300, FBXW7, HLA-B, PTEN, NFE2L2,ARID1A, KRAS和 MAPK1这些已经发表过的宫颈癌的显著突变基因。E542K和E545K是PIK3CA基因的高频突变点，在PIK3CA中其他位点突变显著降低。在膀胱癌与HPV阳性头颈鳞状细胞癌的研究中也有类似结果，但在乳腺癌或其他大多数癌症研究中都没有上述情况。
分析：研究发现，E542K和E545K突变的核苷酸替换模式与胞嘧啶脱氨酶(APOBEC)的诱变有关。此外，APOBEC突变量与每个样本的突变总量密切相关，这表明APOBEC诱变是宫颈癌突变的主要突变来源。
③研究发现每个肿瘤平均有88个体细胞拷贝数改变，采用GISTIC2.0进行拷贝数变异分析进行验证
鉴定到了26个局部扩增区域，37个局部缺失区域。具有高拷贝数的亚类大多包含涉及11q22 (YAP1, BIRC2/3) 和7p11.2 (EGFR) 扩增事件的鳞状肿瘤。具有低拷贝数的亚类大多包含腺癌，并且富集了TGFBR2和SMAD4缺失及ERBB2和KLF5扩增的肿瘤。高拷贝数的亚类和低拷贝数亚类都具有CD274（PD-L1）和PDCD1LG2（PD-L2）的扩增并且显著相关（p<>
④通过分析low-pass(n=50)和deep(n=19) coverage的RNA-seq及WGS数据来鉴定结构重排
在14例患者中检测到22个候选的结构重排，在全部样本中检测出26个复发性基因融合。RNA-seq分析发现有4个样本在16p13位置发生了ZC3H7A-BCAR4的基因融合，具体位置是ZC3H7A中的第一个外显子连到了BCAR4中最后一个外显子上。
WGS分析显示在染色体16p13.13上的BCAR4串联重复序列与拷贝数增加。BCAR4是促进细胞增殖的长链非编码RNA，通过激活HER2/HER3通路来提高细胞增殖从而导致体内形成肿瘤。Lapatinib是一种EGFR / HER2抑制剂，可体外抑制由BCAR4驱动的肿瘤生长，有希望作为BCAR4阳性宫颈癌的治疗剂。
2.分子亚组综合分析：
图二 宫颈癌的多平台综合聚类分析
①使用综合聚类联合潜变量模型（iCluster）整合拷贝数、甲基化、mRNA和miRNA，突出宫颈癌的分子异质性
分析结果：鉴定出对应于mRNA簇主要被分为三个聚类：具有角蛋白基因家族成员高表达的鳞状聚类(Keratin-high)；具有角蛋白基因家族低表达的鳞状聚类(Keratin-low)；腺癌富集聚类(Adenocarcinoma)。KRAS,ERBB3和HLA-A的突变与聚类显著相关，高角蛋白亚类中缺少KRAS突变，腺癌亚类中缺少HLA-A突变。SPRR和TMPRSS角化基因家族成员以及3个SMGs（ARID1A，NFE2L2和PIK3CA）在低角蛋白与高角蛋白聚类之间有差异性表达。
② 使用可变DNA甲基化探针的无监督层次聚类产生了三组：一个小的“CpG 岛超甲基化”（高CIMP）亚类，一个中等CIMP亚类和一个低CIMP亚类。（这三个亚类的分类被认为与EMT（epithelial-mesenchymal transition）分值有很大关系）
结果：腺癌亚类中的大多数样本都是高CIMP，另外两个亚类中都包含中等CIMP与低CIMP的混合。将所有的宫颈癌样本与TCGA项目中抽取的120个正常样本进行比较，发现有1026个沉默基因在肿瘤组织中的甲基化程度大于正常组织。
③PARADIGM综合拷贝数，RNA-seq和通路交互数据
分析：数据分析发现p53，p63，p73，AP-1，MYC，HIF1A，FGFR3和MAPK信号可作为区分鳞状细胞癌的重要特征，类似于其他鳞癌。相比之下，腺癌显示较高的ERα，FOXA1，FOXA2和FGFR1通路的活化。ERα上调的潜在机制可能是源于miR-193b-3p的表达。miR-193b-3p可作为ESR1的直接调节物，与在鳞状细胞癌中相比，在腺癌中其含量显著下调，在基质细胞中有传导雌激素信号的作用。
图三：PI3K–MAPK和TGFβR2通路中体细胞突变的互斥性
①使用互斥模块算法（MEMo）识别互斥基因组改变的致癌网络并且检测miR-200a / b和EMT基因网络的变化
结果：在调节EMT过程中，TGFβ通路与miR-200a / b变化之间存在潜在联系。染色体的缺失和突变会对受体基因TGFBR2、调节基因CREBBP和EP300以及转录因子SMAD4产生影响，通过观察鳞状细胞癌样本，发现它们也很有可能影响由TGFβ驱动的抑制生长和促进凋亡的功能。
分析1：鳞状细胞癌的显著特征是具有miR-200a / b高甲基化和下调，它们富集于低角蛋白聚类中，表现出ZEB1和ZEB2的显著上调，并且与TGFβ信号通路的改变相互排斥。突变的miR-200a / b样品的EMT得分比正常样品更高。由于靶向EMT可能使肿瘤对小分子抑制剂和细胞毒性化学疗法更敏感，所以可从这一角度研究该子宫颈癌亚型的治疗方法。
分析2：MEMo分析表明在与宫颈癌相关的治疗中，RTK、PI3K和MAPK通路存在显著差异并且发现了PI3K和MAPK发生通路改变时的相互排斥模块。然而，在腺癌聚类中存在ERBB2和ERBB3改变同时发生的强烈趋势，表明这些肿瘤样本可能通过HER3突变和HER2活化之间的相互作用来表现出异常的HER3信号，因此研究HER2和HER3的靶向治疗可能对于疾病的治疗十分有益。PIK3CA的畸变也倾向于与PTEN体细胞的突变和缺失共存，这与具有很少拷贝数改变的子宫内膜肿瘤相似，并且表明PI3K通路靶向剂的潜在治疗作用。
3.跨癌症分析
评估宫颈癌亚型与子宫内膜癌，相关癌基因与激素相关致癌作用的关系以及相关癌基因与头颈鳞状细胞癌之间的关系。为此，对宫颈癌、子宫内膜癌（UCEC）和头颈鳞状细胞癌（HNSC）的mRNA表达情况进行分层聚类。
数据分析后，得到三个聚类：
Cluster1：所有UCEC样本和大多数宫颈腺癌，其特征是激素受体基因ESR1和PGR的过度 表达。
Cluster2：主要是鳞状宫颈癌，以及27例HNSC（27例均被检测为HPV阳性）中的23例。
Cluster3：包括极少数宫颈癌和剩余的4例HNSC，大部分都是HPV阴性。 这表明HPV相关鳞状上皮癌在不同解剖部位的相似性。
分析：由于一些样本的宫颈癌与UCEC细胞发生聚集，研发者们开发了基因表达分类器来判断究竟是宫颈癌还是UCEC。通过该分类器，他们将178例被诊断为宫颈癌的患者中的8例归为UCEC样癌，这8位患者中的7例HPV检测均为阴性。8位UCEC样癌患者中的6位属于腺癌亚类，2位属于低角蛋白亚类。UCEC样肿瘤分别占ARID1A，KRAS和PTEN的突变的33％，27％和20％。它们与RPPA激素和miRNA C6簇相关且只有一个样本CIMP和拷贝数较低。
4.HPV基因型、变异与整合
除蛋白测定外的所有其他平台和综合分析都是在样本数目为178例核心组肿瘤中进行。其中，HPV阳性169例，A9型120例，A7型45例，HPV阴性9例。所有HPV阳性患者均可检测到HPV E6和E7癌基因的表达，它们的产物分别对p53和Rb的功能蛋白产生抑制作用。研究表明，与A9相关的HPV阳性的腺癌基因沉默率最高。A7型中含有较低的角蛋白亚类和腺癌亚类，大多数A7型的CIMP较低，并且HPV阴性的样本在低CIMP亚类形成了一个亚组，其启动子甲基化水平显著低于该亚类中其他样品。
功能表观遗传模块分析：使用蛋白质-蛋白质相互作用网络，分析鉴定HPV阳性与HPV阴性宫颈癌间甲基化与基因表达的逆相关性，以及HPV阳性与HPV阴性的HNSC之间的甲基化水平与基因表达的逆相关性。
分析结果：具有统计学意义的12个宫颈癌样本与11个HNSC样本关系密切。miR-944，miR-767-5p和miR-105-5p是HPV阳性和HPV阴性样本之间差异最显著的miRNA。与HPV18阳性鳞状上皮癌相比，HPV16阳性鳞状细胞癌的miR-944表达也显着高于miR-375表达。值得注意的是，与HPV阳性肿瘤相比，HPV阴性肿瘤具有更高的EMT mRNA得分并且具有较低的APOBEC诱变特征频率。
结论
通过全面的分子综合分析，我们确定了宫颈癌新的基因组和蛋白质组学特征。综合不同类型的HPV和分子特征得出三个聚类：Keratin-low squamous、 Keratin-high squamous、Adenocarcinoma-rich clusters。ERBB3，CASP8，HLA-A，SHKBP1和TGFBR2是新发现的宫颈癌SMGs，并将ERBB3（HER3）作为宫颈癌的治疗靶点。该团队首次报道在癌症中涉及BCAR4基因的扩增和融合，它可以由拉帕替尼间接靶向。此外，本研究还鉴定了CD274和PDCD1LG2的扩增，这两个基因编码常用的免疫治疗靶点。发现一组特点是已被发现的KRAS、ARID1A和PTEN发生突变的HPV阴性的宫颈癌，并且发现PTEN和潜在的ARID1A蛋白可作为治疗靶点。有超过70%的宫颈癌在PI3K和MAPK信号通路中的一个或两个中基因组发生突变。 因此，可针对这些信号通路研发治疗剂以用于临床治疗。
这是首次报道是不同类型HPV引起的宫颈癌激活的分子途径，强调了HPV的多样性。总之，这些发现为深入了解宫颈癌的分子亚型提供了依据，并有望在临床上针对不同分型的宫颈癌患者开发不同的治疗方法。
参考文献：
[1] The Cancer Genome Atlas Research Network. Integrated genomic and molecular characterization of cervical cancer[J].Nature, 2017, 543,378–384.
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