基因组分析显示不同癌症之间存在很大的异质性，然而基因组异质性是否以及如何在肿瘤进化中受到限制尚不清楚。本文通过对一系列同步肺癌（MSLCs）患者进行测序，来探究相同种系和生活环境下遗传驱动的多样性和均一性。研究表明每个多灶性原发肿瘤具有不同的致癌突变，包括一些已被验证的具有功能性和治疗靶标价值的新突变。然而，功能性研究显示，异质遗传突变体内存在明显受限的致癌通路。这些研究结果表明，虽然细胞在肿瘤发生过程中采用的特异突变路径是随机的，但是其遗传轨迹可能受限于对富集的关键信号通路的选择。本文研究结果突出强调了在进化压力下基因组多样性的扩张和约束，这个原理在理解肿瘤发展和优化治疗策略中具体重要的应用意义。
文章题目：Simultaneous evolutionary expansion and constraint of genomic heterogeneity in multifocal lung cancer
研究人员：来自上海交通大学医学院，仁济医院的研究团队
发表时间：2017. 10
期刊名称：Nature communications
影响因子：12.124研究背景
癌症被普遍认为是一种进化性的疾病，由零星的致癌突变引起的癌变前细胞与正常细胞相比，其可以更快地转移并且更好地承受生存压力，进而形成肿瘤。许多已形成的肿瘤具有遗传不稳定性，产生累积额外突变的趋势，从而造成肿瘤内的恶性细胞不断增多。这其中一个重要的原因是大量的基因组多样性引起广泛的肿瘤内异质性和系统发育不同。大量的研究证据表明，遗传多样性和分子进化对同时患有多种癌症的病人的临床病程具有重要影响。
在研究引发癌症原因的一个未被解决的关键问题是：在一般研究方案的框架中，肿瘤的基因组多样性造成表型异质性的程度有多大？普遍认为癌症遗传谱是以存在表型可塑性的形式出现，以便于肿瘤动态适应来自免疫和治疗的压力。然而，在给定环境下进化约束可能会限制肿瘤遗传驱动的选择从而造成表型的收敛，已经有证据初步证明这个假设。比如：不同肿瘤的亚克隆或者不同的转移位点在致癌过程或药物治疗中常常经历相同基因、通路或者蛋白质复合物，是一个平行进化过程；同样的，一个Von Hippel Lindau（希佩尔·林道综合征，一种罕见的常染色体显性遗传性疾病）病人体内四个相互独立的肿瘤都会反复出现mTOR通路的活化。这些研究中值得注意的是：研究使用的肿瘤克隆或者亚克隆具有大量相同的体细胞突变和一些已知种系癌症易感基因，这可能对进化分歧的内在边界进行了定义。从治疗角度来看，一方面要增强对扩张竞争力的理解，另一方面肿瘤发生过程中基因组多样性和异质性限制的干预对于精准破译人类癌症至关重要。
MSLC指被诊断为相同或者不同肺叶中具有多个肿瘤结节的患者，因此，同一个MSLCs患者体内的肿瘤具有相同的遗传背景和生活环境。MSLC在肺癌中频繁发生，但是关于同步多发肿瘤中的分子起源以及关系还尚未确定。通过对MSLC基因组分析确定其起源是否相同，是迄今还未被研究的领域，该领域研究将为肿瘤形成的进化机理提供一个独特的研究方向。
本研究对MLSC患者的临床样本进行了详细的遗传分析和实验分析。通过全外显子测序揭示了每个患者体内同步损伤的独立性克隆，以及病灶内和病灶间的基因组异质性。然而，同步多发肿瘤的重要信号通路中不同致癌驱动因素的功能收敛可能是一个普遍性的原理，并有助于选择合理的治疗方案。因此，基因组异质性的同时进化扩张和收敛可能竞争且协同地的促进肺癌或者其他恶性肿瘤的形成。
研究方法
1 MSLC的克隆架构和突变情况
为了进一步了解形成肺癌肿瘤的遗传突变，研究人员采用4名(Table1)接受初始治疗的患者(11处独立病变的16个肿瘤样本，都属于腺癌)以及相邻的正常组织DNA进行了全外显子测序比较。平均覆盖度为244x(205x-296x)。大约99%的靶标基因的覆盖度在20x以上。研究人员在每个肿瘤组织中识别出了167-679个体细胞突变，至少一个肿瘤区域中总共存在373个非同义突变。为了确定MSLC是从一个具有胸部转移或多个局部原发性肿瘤的单一病变中衍生出来的，非沉默突变被基于瘤内分布进行了共有(出现在一个肿瘤以上)和特有的分类(只出现于一个肿瘤中)。此外，研究者构建了系统发育树来评估每个病灶的遗传关系(Fig.1a)。4个病人体内任意一对肿瘤之间不存在共有的变异集，这和最近研究证明MSLCs是独立克隆的起源保持一致。对两块较大的肿瘤组织进行多位点取样测序发现，同一个肿瘤的多个测序样品里存在很多共有的体细胞突变(Fig.1a)。这一观察表明一个受试者体内多个肺结节可能起源于不同的细胞。
Table1 MSLC组患者特征
在同个体内肺癌的SNVs突变谱是一致的，然而在患者RJLC3中却观察到了明显的不一致性。大多数样品测试显示了C>T和T>G颠换的优势，而非与烟草暴露相关的C>A转换(Figure.1b),这一现象与患者的非吸烟史是相一致的。研究者检测了先前报道过的在肺腺癌中反复出现的基因遗传突变（EGFR，KRAS，MET，BRAF和TP53）。其它的候选驱动突变则常常影响基因的调控转录、MAPK信号、细胞粘附和存活的基因(Figure.1b)。总体来说，任何两个肿瘤之间的共有驱动突变都很少，进一步表明这些MSLC组是独立原发性肿瘤。将所有样本分为两个簇，突变特征的详细分析表明来自同一患者体内的肿瘤常常聚集到一起(Fig.1c)，RJLC3患者除外。这个结果验证了不同部位肿瘤病变的发生是由不同的突变过程造成的。接下来运用deconstructSigs框架来提取每一个簇中可能促进特定突变特征中已知的突变特征。有趣的是，cluster1显著富集了特征1(年龄相关)，特征3(同源重组的DNA双链断裂失败相关)，特征9(促进聚合酶η并与AID活性相关)和特征12(病因不明)。与此形成鲜明对比的是culster2几乎完全以特征9表征，该特征之前在肺癌中没有相关描述，仅在慢性淋巴细胞性白血病和恶性B细胞淋巴瘤中有记录，要确定这些发现的机制基础和生物学意义需要进一步的研究。
Fig.1
2 MSLC的病灶间和病灶内部的遗传异质性
MSLC的深度基因组测序可以在患者间、病灶间、病灶内等多层水平上描述肿瘤异质性(Fig.2a)。每个MSLC患者具有特定的体细胞突变，经过不同的突变谱和大量的非重叠外显子取代进行验证(Fig.2b)，这和肺癌的TCGA的遗传异质性是一致的。遗传种系的倾向分析未发现有意义的且与肺癌易感性相关的SNP，进一步表明了每个肿瘤是由不同的体细胞遗传改变的驱动结果。
为了进一步证实系统发育分析揭示的内分泌多样性，研究者在功能上推断了每个肿瘤中最突出的癌症驱动异常。KRAS是一种原癌基因，在RJLC2-T2(KRASG12D)和RJLC3-T3(KRASG12C)上，这可能引起MAPK信号的传导。类似地，RJLC1-T1，RJLC1-T2和RJLC4-T1/T2/T3激活EGFR突变(EGFRL858R、EGFRE746-A750 indel)或ERBB2的插入(HER2YMVA)来增强癌化过程。MET突变可引起RJLC2-T3(c-METΔE14)和ARAFS214C中14号外显子跃，这在最近的报道中被证实其在临床模型和肺腺癌患者中具有致癌性。在RJLC2-T3中也可以检测到ERBB3(HER3)和PDGFRB基因的突变，但是研究者发现这些突变不会造成AKT或ERK实质性突变。值得注意的是，两个位于蛋白激酶结构域中与临床相关的潜在突变，RJLC2-T1中的BRAFD594G和MAP1K1中的MEK1E102-I103 indel(MAP2K1编码)。每种突变即使先前在各种癌症类型中被发现，但并没有明确地参与到肺部恶性肿瘤的驱动中。为了表征BRAF和MEK1突变的对功能的影响，我们使用KRASG12D作为阳性对照，采用人类胚胎肾细胞系KEK293T的异位表达突变的等位基因（一种永生化支气管上皮细胞系BEAS-2B和肺腺癌细胞系LXF-289）。有趣的是BRAFD594G在HEK293T中表现出对下游MAPK通路的减毒催化活性，与其高度保守的DFG基序以及先前报道的激酶失活性质是一致的。BRAFD594G在细胞BEAS-2B或LXF-289中是以依赖RAS/CRAF的方式转化，这一结果通过phospho-ERK评估以及克隆形成和异种移植瘤的测定得到的(Fig.2c−e)。另一方面，MEK1E102-I103 indel在三种细胞系中表现为生化获得功能突变(Fig.2c−e)并且和体内的MEK抑制剂密切相关。重要的是，研究者建立了病人肺肿瘤BRAFD594N来源的模型，增强了野生型BRAF的克隆生成。研究人员观察到在靶向治疗中对MAPK通路明显的敏感性，特别是当dabrafenib和trametinib这两种药物组合使用的时候。这些数据的结果揭示了BRAFD594G和MEK1E102-I103 indel在肺癌中的致癌性和靶标性。病灶间异质性在MSLC中非常常见，因此，每一个同步多发性肿瘤可能是由不同的分子机制驱动的。此外，所有的MSLCs都表现出CD3染色阳性，表明在早期肺癌中T细胞已经渗透到肿瘤细胞中，每一个病变都可能会有不同的谱系和不同的抗原负荷，这预示着肿瘤相关淋巴细胞的功能异质性和对治疗方案不同的临床免疫反应。
为了评估MSLC病灶间异质性的程度，研究者首先运用PyClone38和SciClone39进行了单样本的克隆分析。两种方法都显示大多数样本测序为寡克隆。然而假定的驱动突变被证明大部分克隆是基于癌细胞百分比的基础上(百分比是指携带SNVs的癌细胞)(Fig.2f),这一结果与之前报道的肺癌的驱动突变发生于早期是一致的。此外，两个较大的肿瘤(RJLC1-T1和RJLC4-T1)都进行了多区域测序(Mseq)，以便于更全面的探测病灶间进化。结合之前的观察，对M-seq数据进行系统图发育重构，生成了分支进化的模型(Fig.2g)。这两种肿瘤的ITB(截短突变分支指数)比最近由M-seq分析的肺腺癌都要高。每个肿瘤的点突变谱显示了SNVs早期(主干)和晚期(分支)的时间差异。这和之前的相关报道一致，较高比率的体细胞突变可归因于：在两个肿瘤中APOBEC相比于主干而言在分支上介导诱变调节。此外，空间异质性，如散发性突变特征指示，根据位置划分的肿瘤区域具有显著性(Fig.2g)。综上所述，这些发现表明动态突变过程随着时间的推移形成了亚克隆基因组，从而促进大量的病灶间异质性的形成。
Fig.2
3 多病灶病变中受约束的致瘤通路
研究人员注意到在每个MSLC中同一信号通路的病灶之间存在着显著的异质性驱动的生物学收敛。比如，RJLC1和RJLC4都改变了EGFR家族的受体络氨酸激酶，然而RJLC2和RJLC3更倾向于影响MAPK通路。虽然这种现象让人联想到之前讲到的平行进化原理，但是这种明显的生物学收敛功能的推动力及其对肿瘤形成和治疗的影响尚未得到解决。比如，这个领域中一个尚未解决的问题就是在不同肿瘤中是否存在特定的且不同的遗传突变，造成相同或者不同治疗响应的产生。因此研究人员使用了独特的MSLC体系来验证每个患者中不同的驱动突变是否功能互换，这个原理已经存在但是没有在肺癌中被验证。研究人员设计了一个实验工作流程，使用CRISPR-Cas9 system(Fig.3b)特异性控制肺癌的细胞群体。最后敲除PC9细胞中的EGFRE746-A750 del，它会减弱phospho-AKT 和phospho-ERK，没有PC9的EGFR细胞的存活时间很短。当往这些细胞中引入HER2YMVA后，受损的AKT和ERK磷酸化以及生长能力都得到了很好的修复(Fig.3c)。因此，用HER2YMVA代替EGFRE746-A750 del对erlotinib来说是异常敏感的，erlotinib是对HER2活性较低的EGFR抑制剂，而不是像afatinib或者dacomitinib各自抑制EGFR2的激酶活性(Fig.3d)。为了构建RJLC2和RJLC3模型，研究者将这种方法应用于KRAS突变体的NCI-H1944细胞，发现BRAFD594G, c-METΔE14、ARAFS214C、MEK1E102-I103 del的表达确实可以在功能上消除KRASG13D的缺失(Fig.3e)。用携带KRASG12A的NCIH2009细胞得到类似的结果。从而可以得出MSLC独立肿瘤中的进化轨迹可能受到约束从而引起致命致癌通路的优先激活。
Fig.3
4 致癌通路收敛的独立性验证
有一些补充信息进一步佐证该研究队伍所发现的MSLC发展中体细胞突变的生物学扩张收敛原理。首先，近期的小细胞MSCL病人组的基因组测序揭示了在不同肿瘤中相同癌基因的频繁突变共存，即使这些细胞起源于不同的细胞。其次，研究者再次鉴定了两名患有同步肺癌和乳腺癌的患者(RJLC5和RJLC6)(Fig.4a),她们都接受了肿瘤切除手术，研究者收集了这些病人的新鲜组织进行了全基因组测序(WGS)，基于体细胞的突变显示了肺癌和乳腺癌肿瘤细胞的独立性克隆。Circos图分析显示这些同步肿瘤之间没有共同的结构突变，进一步证实了这些肿瘤是通过不同的遗传事件累积发展而成(Fig.4b)。每个患者的两个肿瘤尽管来自于不同的组织但具有很相似的突变谱和突变特征。另外，研究者识别出c-METΔE14、HER2Y777L、EGFR-KDD、和HER4N855K是肿瘤中具有主导性的四种突变(Fig.4b)，这表明了酪氨酸激酶受体在肺癌和乳腺癌中的中心收敛作用。最后，研究者测试发现在前瞻性研究结果中该研究具有潜在的治疗意义。患者RJLC7由于持续的感染住院，随后诊断为MSLC，在三个肺部结节中出现了一些磨玻璃影(GGO)。2018年8月，病人接受了视频辅助胸腔(VATS)指导下的右上叶、右下叶以及淋巴的切除手术。两个相对较大的病变被切除，病理学分级为pT1N0M0IA期肺腺癌。WES表明RJLC7-T1和RJLC7-T2都是多中心原发性肿瘤，但是有相同的突变谱和突变特征，两种肿瘤都具有FGFR3中心的扩增功能。此外，研究者在RJLC7-T2和RJLC7-T1中分别检测到BRAFN581S和EGFRL858R (Fig.4c)，并运用扩增难治性突变系统(ARMS)进行了证实。即使在左上叶的几个小结节呈现局部病变，但是患者拒绝了继发性外科手术以及分子分析活检，进而选用了脱标签的gefitinib药物治疗以了解她早期疾病的进展。对患者进行全程观察并做了GGO回归分析(Fig.4d)。虽然这些数据都必须谨慎使用，但EGFR靶标药物的反应显示多病灶的区域对EGFR信号传导的依赖性，这与在RJLC7-T1中发现被激活的EGFRL858R突变是一致的。这些发现为MSLC的收敛演化提供了充分的证据。截至目前患者仍在接受治疗，并且没有显著的不利影响。作为扩展，多中心计划开展临床调查以确定MSLC患者肿瘤进展中的扩张和收敛的程度以及意义。
Fig.4
讨论
从进化生物学角度来看，癌症是一个肿瘤细胞和微环境相互作用不断发展的生态系统。最适应的克隆的生存和扩张都符合达尔文自然选择规则。而且，不稳定性是人类肿瘤的一个重要的特性，随机诱变不断发生可能会改变克隆适应的表型。这些新突变的轮番出现和无处不在的阳性阴性选择不可避免的造成了肿瘤内和肿瘤间的异质性。实际上，研究者提供的MSLC病灶内和病灶间的基因组分子图像解释了即使在每个受试者具有相同遗传背景和生活环境下仍然具有大量的异质性。这些数据验证并拓展了之前在非小细胞肺癌中观察到的明显的肿瘤内异质性，异质性被推测复杂化了致命疾病的分子诊断和临床治疗干扰。
然而，遗传异质性的功能性和临床相关性的程度是仍待解决的问题。本文研究解释了大部分重要驱动突变是主克隆并且看似不同的多灶性肿瘤常常在选择致癌通路时收敛，这为功能互换提供了证据。值得注意的是，研究者基于CRISPR-Cas9系统开发了一种特定的实验流程，并且正式证明了对于每一个MSLC的不同病灶给予等效的信号输出和治疗反应具有不同的遗传突变。因此这些数据有力的支持了在肺癌初期和进展中进化收敛的存在。总之，本文的研究强调了基因组多样性和表型约束的共存，这可能是认识肿瘤进展的一个普遍原理，可能对识别和优化治疗方案具有潜在的作用。
总之，该项研究的发现不仅为运用基因组测序来区分MSLC患者可治愈的多发原发性肿瘤和不可切除的转移性肿瘤提供了合理的应用，而且也为肿瘤发生过程中驱动突变的平行进化和复发模式的评估提供了初步的证据。更加深入的了解控制肿瘤基因组多样性和异质性的同时扩张和收敛两种进化力量的抗争将有助于肺癌和其他恶性肿瘤的诊断治疗。
材料方法
1 患者信息描述：所有的肿瘤样本来源于5个MSLC患者，其中两个是肺腺癌和乳腺癌患者。所有的患者都接受手术切除后再接受其他形式的辅助治疗，样本来源于上海交通大学医学院，仁济医院。肿瘤样本大小范围在0.5cm-3.6cm，详细的临床描述见Table 1。对18个来源于5个MSLC患者的肿瘤样本进行了全外显子测序，对来自于同时患肺癌和乳腺癌的四个样本进行了全基因组测序。
2 肿瘤组织处理过程：病理学家对每一个肿瘤组织样本选取最多10um的新鲜冻样以及旁边的正常组织。由经验丰富的的肺癌病理学家决定HE染色切片来判定组织的非恶性基质细胞相比于恶性细胞的比例以确定组织病理学亚型。对5 x 5 x 5mm3肿瘤组织用于DNA的提取。DNA通过Qubit进行量化，DNA完整性检测通过琼脂糖凝胶电泳。
3 全外显子测序：paired-end DNA的建库根据Agilent手册进行，患者的基因组DNA通过Covaris S220超声波打碎为180-280bp长度的片段。运用Illumina Hiseq 4000 测序平台完成paired-end 150bp片段的测序，测序深度为200x。
4 全基因组测序：每个样本提取1ug的DNA进行建库，将其打碎为350bp长度的片段。运用Illumina Hiseq 4000 测序平台完成paired-end 150b片段的测序，测序深度为60x。
5 序列比对和变异体识别：将得到的clean FastQ运用BWA和人类基因组UCSC hg19进行比对，结果文件储存为BAM格式。SAMtools，Picard (http://broadinstitute.github/io/picard/), 然后采用GATK处理所得的BAM文件并计算序列的覆盖率和深度。运用VarScan version 2.2.5和 MuTect识别体细胞SNVs，运用GATK Somatic Indel Detector检测体细胞InDels。ANNOVAR用来处理得到的VCF文件。用到的基因转录注释数据库有Consensus CDS, RefSeq, Ensembl和UCSC。只有那些出现在外显子或者标准的检测位点的SNVs用于后续分析，剩余的非同义突变通过PolyPhen和SIFT进行功能预测最后采用Control-FREEC检测体细胞CNV。
6 假定驱动突变的识别：将检测到的所有非沉默突变和NSCLC中的潜在驱动基因进行比较，将p<><0.05或者ployphen得分> 0.995。然后在DNA充足可用时将这些假定的驱动突变进行Sanger测序验证。突变蛋白结构从Phyre2中获得，制图通过PyMOL完成。
7 突变谱分析：通过沉默和非沉默体细胞SNVs以定义突变特征。对每一个肿瘤样本，参考hg19参考序列组提取5’和3’端序列中的突变，根据取代类型将SNVs划分为C>A, C>G, C>T, T>A, T>C和 T>G类，然后继续根据5’和3’端突变碱基继续分解为96类。运用R的deconstructSigs包量化每个肿瘤特征的贡献以便于将已知的突变特征和Wellcome Trust Sanger Institute Mutational Signature Framework进行比较。
8 克隆分析：运用PyClone和SciClone检测亚克隆。PyClone运用MCMC方法进行变异体聚类。SciClone侧重于基因组的拷贝数变异，杂合缺失识别。
9 癌细胞百分比分析：癌症细胞百分比(CCF)得分定义为 ：
10 新抗原预测：使用Polysolver进行HLA分型。使用NetMHCpan算法预测每个突变残基的结合能力。结合力比野生型小并且小于500nm被判定为新抗原。
11 细胞培养和试剂：从ATCC或者JCRB中获得肿瘤细胞系，进行细胞表征和感染。细胞培养在补充10%牛血清的RPMI1640中（Erlotinib, afatinib, docamatinib, trametinib, dabrafenib, and lapatinib购自Selleck Chemicals）。所有的抑制剂储存在10mM的DMSO中。在细胞活力测定中，将细胞以每孔100000个细胞接种在补充有10%的FBS和2mM-L谷氨酰胺生长培养基的6孔板中，粘附过夜并连续使用稀释的抑制剂处理一周。用结晶紫染色并用福尔马林固定细胞。
12 CRISPR-Cas9 敲除：采用CRISPR-Cas9敲除技术分别敲除P9中的EGFR,以及H1944和H2009中的KRAS。
13 统计学分析：运用GraphPad Prism软件进行统计分析。Student’s t-test和ANOVA用于多组别之间的差异比较，P-values <>
参考文献：
[1] Pengfei Ma, Yujie Fu, Mei-Chun Cai, et, al.[J].Nature Communications, 2017,823:Published online.
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