文章题目：Innate Immune Landscape in Early Lung Adenocarcinoma by Paired Single-Cell Analyses
研究人员：美国纽约州西奈山伊坎医学院肿瘤科学系的研究团队
发表时间：2017. 05
期刊名称：Cell
影响因子：28.71研究简介
为了指导早期肺癌患者的免疫治疗方案设计，我们绘制了早期肺腺癌的免疫图谱以寻找肿瘤驱动的免疫改变。我们利用一种条码方法( barcoding method )，可以对肿瘤细胞，正常细胞和外周血细胞同时进行单细胞分析，以此来绘制早期肺腺癌肿瘤微环境中免疫细胞的详细图谱。研究发现I期肿瘤就能够使得T细胞和NK细胞隔间发生显著改变。此外，还鉴定到I期肿瘤使得肿瘤浸润髓系细胞（TIM）亚群发生变化，这可能对有抗肿瘤功能的T细胞免疫不利。配对的单细胞分析为肿瘤驱动的免疫细胞的变化提供了相关的理论背景，并为合理设计免疫治疗提供帮助。
免疫检查点阻断主要是通过去除调节性T细胞(Treg)，解除Treg对T细胞活化和增殖的抑制。目前，研究人员已开始对晚期肿瘤中T细胞的功能和分布展开研究，从而可以更有把握的制定抗肿瘤T细胞免疫的新策略。
髓系细胞在肿瘤位点具有调控T细胞的功能。然而，对于肿瘤部位的髓系细胞的多样性却知之甚少。髓系细胞包括单核吞噬细胞、粒细胞等。单核吞噬细胞即单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞(DC)。髓系细胞能够通过清除受损细胞、促进免疫效应帮助组织和细胞修复。但在肿瘤微环境中的髓系细胞已被证明能够诱导免疫耐受并帮助肿瘤进展。在TIM中，DC能够驱动T细胞活化，CD103+ DC是DC的一个亚群，研究发现其能够调控局部T细胞活性。因此，TIM可能具有调控肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的成分、活性、抗肿瘤功能的能力。利用TIM的功能也许能够提供一种增强T细胞靶向免疫治疗的协同策略。
如果能够绘制肿瘤微环境中免疫细胞图谱，将会对非小细胞肺癌的免疫治疗策略的设计有很大帮助。为此，我们开发了一种多尺度免疫分析策略来绘制早期肺腺癌微环境中免疫细胞图谱。通过我们设计的一种条形码策略可以同时对病人位于肿瘤组织、正常组织和外周血中的免疫细胞进行单细胞分析，识别出由肿瘤驱动的免疫过程。使用飞行时间质谱分析法(CyTOF)并结合单细胞转录组学及肺部肿瘤的多层组织图像，我们识别到了在肿瘤组织中出现的自然杀伤细胞(NK)和骨髓系细胞特有的应答。这些变化早在肿瘤I期时就已经发生并可能开始降低免疫细胞的抗肿瘤能力。这些数据表明针对早期肺腺癌免疫细胞开发的辅助免疫治疗的策略，具有恢复TIL微环境以及将肿瘤应答转变为检查点阻断的潜能。
图1 研究概览
研究方法
样本选择：
32位患者体内提取NSCLS肿瘤组织（包括肿瘤组织，正常组织以及外周血）
公共数据：
根据不同的转录模式从TCGA数据库中分层选择了515例肺腺癌患者的数据
研究成果
肺部肿瘤多维度单细胞分析
为了确定肺腺癌的肿瘤微环境，我们对新切除的肿瘤进行多尺度免疫分析。选择在当天进行手术的病人（Patients selected were treatment naı¨ve at the time of surgery），从病人体内获取NSCLS 肿瘤组织(包括肿瘤组织、正常组织和外周血)。在32个病人中，有28位被诊断为肺腺癌。（这些病人在年龄、性别、突变位点和主要组织分布亚型方面的分布比较典型。）
为了区别肺部肿瘤微环境免疫细胞的改变，我们试图同时匹配肿瘤组织、正常组织和外周血中的免疫细胞。为此，我们开发了一种条形码方法（barcoding method ）可以同时分析三种样本的细胞。在最初的18个病人的样本集中，从肿瘤组织、正常组织和外周血中分离出的免疫细胞在混合前使用CD45抗体barcoding，再成对的使用金属同位素标记。将30余种抗体与混合后的样本一起染色并用CyTOF分析，从而可以测量每个病人各个组织免疫细胞的单细胞表达。随后将质谱分析扩展到另外10个肺腺癌患者的细胞检测中。
T细胞和巨噬细胞调控早期肺腺癌微环境
使用viSNE将多维数据可视并且保留单细胞的分辨率，我们分析了不同免疫细胞系的分布，这些细胞来自病人的肺部肿瘤病变组织，正常组织和外周血。与正常组织相比，肿瘤组织中积累的免疫细胞数量更多。肿瘤部位的免疫细胞包含所有主要的免疫细胞系，其中含量最丰富的是T细胞和巨噬细胞。巨噬细胞在正常组织和肿瘤组织中的含量相似，粒细胞也是如此。但在肿瘤微环境中T细胞和B细胞出现的频率较正常组织中高。肺腺癌患者的NK细胞出现的频率在各项检测中都较低。
我们也分析了在肿瘤环境中产生的细胞因子和趋化因子。尽管许多细胞因子和趋化因子在肿瘤中比在血液中有更高的表达水平，但在肿瘤和临近的正常组织中也经常可以检测到相似表达水平的趋化因子，这也潜在的反映了肿瘤分子产生的可溶性分子局部扩散到了临近的肺组织。这种关系也会受到巨噬细胞浸润的频率的影响，比如CX3CL1由于受到影响在肿瘤组织中的表达就稍高于正常组织。
近期的研究表明，细胞的组成以及免疫细胞在肿瘤位点的空间分布都能对肿瘤造成影响。使用我们近期在实验室开发的一种新的肿瘤分析方法——“单个载玻片多重免疫组织连续染色法”(multiplexed immunohistochemical consecutive staining on a single slide)（MICSSS），通过该方法对免疫细胞在肿瘤和正常组织中的分布进行了评估。与之前描述的一致，免疫细胞主要聚集在肿瘤岛(tumor islets )周围的基质和肿瘤侵袭边缘中，一些巨噬细胞和T细胞可以进入到肿瘤组织中。许多患者的三级淋巴结构(TLS)聚集在肿瘤侵袭边缘附近并且不存在于正常细胞中。在肿瘤位点进行CyTOF测量，发现在富集T淋巴细胞，但含有少量巨噬细胞的TLS中易有肿瘤病变发生。
为进一步探测在肿瘤位点免疫应答反应的过程，我们使用Phenograph算法分析了所有病人三种组织细胞(肿瘤、正常、外周血)的CyTOF数据来系统地识别常见的细胞群落。我们首先基于每一位病人的肿瘤位点、正常肺组织和外周血单核细胞（PBMCs）共享的蛋白质表达产物进行单细胞聚类，然后使用第二次聚类分析进行归并聚类分析来确定患者和组织中的meta聚类(metaclusters )。
肿瘤组织富集调节性T细胞和非功能性T细胞
对所有病人的三类组织的Phenograph聚类结果表明，T淋巴细胞的meta聚类和已知的免疫细胞集群具有一致性并且在肿瘤组织位点有一个独特的分布（图2）。
图2 同时对肿瘤组织、正常组织、外周血细胞进行免疫检测分析
配对的质谱分析显示出T细胞亚群独特的组成和表型（图3）。调节性T细胞(Treg)在所有患者甚至是早期患者中的含量显著增加。重要的是，在肿瘤早期阶段Treg快速增长。并且在肿瘤组织处，CTLA4、CD39、ICOS和41BB在Treg中的表达水平要比T细胞中高。在正常组织处Treg中的Foxp3、CTLA4、PD-1、 CD39、 ICOS、CD38和41BB高表达，但CCR4的表达较低。在肿瘤组织中，CD8+ T细胞的溶解频率明显降低，并且粒酶B和IFNγ的表达量也变低了。效应T细胞/Treg的比率数值降低，可作为肺部肿瘤的标志。
图3 不同组织中免疫细胞的分布
通过检测检查点分子PD-1在各个组织中的T细胞内是否有表达产物，以确定抗PD-1检查点阻断是否成功。肿瘤组织的一个特点是在一小部分CD4+和CD8+T细胞中有明显的PD-1表达，并且在Treg中表达量稍低。CD8+T细胞在肿瘤位点以及TLS中都发生聚集并保持优先地位，此外，TLS的密度会影响T细胞受体(TCR)的克隆能力。比如，在TLS高密度的肿瘤组织中，T细胞增长速度很快。此外，在肿瘤组织中TCR克隆能力较低时，有一个明显与TCR克隆能力增加有关的一个T细胞亚群——CD8+PD-1+T细胞。但在正常组织中没有发现这个亚群。以上结果表明CD8+T细胞在肿瘤位点克隆扩增，并有表达产物PD-1，这种扩增在TLS丰富的肿瘤组织中极易发生。
Cytolytic NK细胞被排除在肺腺癌病灶外
除了测定肿瘤的自适应免疫应答之外，我们着重分析了肿瘤部位中NK细胞的先天免疫能力。与正常肺组织相比，NK细胞是在肺腺癌病灶中含量最少的免疫细胞，并且表达CD16的NK细胞亚型也很少，但浸润于肿瘤组织中的NK细胞CXCR3的表达水平比在正常细胞中高。此外，在肿瘤位点的NK细胞溶解能力低，表达少量的粒酶B、CD57和IFNγ。相反的，由于NK细胞的功能是消除MHC I类缺陷细胞，我们运用MICSSS方法评估肿瘤细胞中MHC I类细胞的分布（图4）。肿瘤部位MHC I类表达频率降低使得浸润于肿瘤位点的CD16+NK细胞数量增多，这表明NK细胞的出现可能会导致MHC I类细胞发生免疫编辑。
图4 来自代表性患者的免疫组织化学染色，描绘肿瘤中染色MHC I
揭示肺腺癌部位肿瘤浸润髓系细胞(TIM)的多样性
为了解TIM的多样性，我们首先运用了无偏差单细胞转录组分析策略对肿瘤部位聚集的非淋巴细胞进行分析，并对1期患者的正常细胞进行大规模平行单细胞RNA测序。使用无偏期望最大化算法对富含TIM的细胞进行单细胞RNA测序，基于特征基因的表达区分出一些不同类型的免疫细胞。其中我们鉴定出3个具有MHCII类分子高表达的聚类，分别是CD1C、CCL22、CD207。鉴定巨噬细胞和单核细胞的聚类是基于CD68、MAFB和CSF1R不同的表达量。肿瘤部位的巨噬细胞与正常肺组织的巨噬细胞的聚类结果是不同的，表明与肿瘤相关联的巨噬细胞和正常肺组织的巨噬细胞是不同的。
为了进一步了解病人的TIM多样性(分型)，我们应用同步的CyTOF分析了PBMC(外周血单核细胞)、正常肺组织和肿瘤中的免疫细胞，系统化的定义了髓系细胞群。对全部病人所有组织样本的Phenograph聚类证实肿瘤中的髓系细胞，巨噬细胞，DC亚群，和单核细胞亚群都是基于蛋白标志物的表达进行识别的，包括CD68,CSF1-R, CSF2-R, CD11C, CD1C, CD141, 和 HLA-DR等等（图5）。肺部和PBMC的TIM是不同的，配对CyTOF分析显示肿瘤组织中CD14+和CD16+的单细胞亚型在分布和功能上是独特的。CD14+相比较于其它单核吞噬细胞而言可以产生大量的细胞因子，但是它们在肿瘤位点只能产生少量的IL-8和IL-1β。在浸润于肿瘤组织程度相同的情况下，相比较于CD14+单核细胞，CD16+单核细胞在肿瘤组织中数量较少并且和肿瘤组织中NK细胞的浸润有很高的关联度。
最后，肿瘤组织和正常肺组织具有同样丰富的中性粒细胞和酸性粒细胞，但是碱性粒细胞含量较少并且过度消耗肥大细胞。
图5 通过Phenograph算法进行CD3-细胞聚类的热图
绘制配对免疫细胞图谱揭示在肺腺癌中独特的巨噬细胞特征
单细胞转录组学分析明显显示出巨噬细胞的各个聚类在肿瘤和正常肺组织中的分布是不同的。比较肿瘤细胞和正常肺细胞中巨噬细胞聚类，发现肿瘤相关的巨噬细胞具有独特的转录特征。
对所有样本的配对CyTOF分析表明肿瘤巨噬细胞建立了一种独特的特征，与正常肺组织相比，肿瘤巨噬细胞免疫调节转录因子PPAPγ的表达水平更高，其CD64、 CD14、 CD11c水平也更高，同时具有较低水平的CD86和CD206 。
单细胞转录分析在肿瘤部位识别了巨噬细胞的一种额外的转录上调，包括在TREM2细胞上表达的触发受体、跨膜四蛋白CD81、具有胶原结构的巨噬细胞受体（MARCO）和载脂蛋白E。为了探究这个不同的转录标签是否存在于其他病人中，我们根据不同的转录模式从TCGA数据库中分层选择了515例肺腺癌患者的数据，观察到了显著的生存劣势，其中肿瘤组织中巨噬细胞的基因表达比例比正常组织中高，这表明此项研究中巨噬细胞的特征可能包含着新的肺癌治疗的靶点。
由于抗PD-L1的临床效果较好，我们使用成对质谱仪分析检测了PD-L1在肺部肿瘤部位的分布。其中，在巨噬细胞和肥大细胞中表达量最高。这和我们在小鼠中的实验结果一致，并且表明PD-L1在肺部免疫稳态中潜在的生理学意义。通过分析PD-L1+巨噬细胞的空间分布发现它们在肿瘤浸润边缘聚集，并与T细胞在肿瘤组织的浸润程度呈负相关。但在正常组织中不存在此类现象。
肿瘤巨噬细胞会自发产生IL-6，其含量显著高于正常肺组织的巨噬细胞产生的量。考虑到IL-6在肿瘤侵袭过程中的角色，且巨噬细胞和T细胞在肿瘤位点的存在呈负相关，以上结果表明早期肺腺癌肿瘤部位的巨噬细胞具有免疫抑制功能。
CD141+DC具有独特的表型并且被排除在肿瘤病灶之外
DC主要负责抗原呈递并在抗肿瘤T细胞免疫中起到关键作用。肿瘤组织和正常组织的单细胞转录组分析显示有两个DC聚类，其中一个具有CD207、CLEC9A,和 XCR1的高表达水平并且与CD141+DC类似。我们同样检测了第二个DC聚类，它具有CD1c、CX3CR1 和 IRF4的高表达水平并且推测可能是CD1c+ DC。CD1c+ DC聚类同样具有CCL22和CCL17的高表达水平，CCR4的配体主要是通过CD4+T细胞表达，并且比CD141+DC具有更高的溶菌酶转录水平。
配对CyTOF分析识别了所有病人肿瘤位点的两种DC亚型。CD141+DC在肿瘤中显著减少，肿瘤部位CD1c+ DC/CD141+ DC的比值因此增加。CD1c+ DC能够表达和CD14+非常相似的细胞因子谱并且可以在肿瘤和正常肺组织中产生IL-6、IL-8和 IL-1β细胞因子。使用MICSSS分析，我们发现被TLS浸润的部位，含有DC并且距离T细胞很近，这与它们在T细胞活化增殖过程中的作用有关。
肺腺癌具有独特的免疫特征并与肿瘤淋巴结转移（TNM）相互独立
总而言之，我们的实验结果绘制了一个早期(未接受治疗)的肺腺癌免疫细胞图谱。展示了这些部位富集了PPARγhiCD64hiCD14hiPPARγhiIL-6hi巨噬细胞、CD1c+ DC、调节性T细胞和耗竭性T细胞及CD141+ DC, CD16+单核细胞，NK细胞和粒酶B效应器细胞。这些细胞可能会共同促进形成免疫抑制的微环境。
由于TNM分期被用于判断预后和选择治疗方案，我们尝试检查对于不同TNM分期，肿瘤位点中免疫组织的是否存在显著差异。除了中性粒细胞和TNFα在II期和III期患者中的产生增加，其它所有在晚期患者中检测到的免疫变化都在I期肿瘤出现了。巨噬细胞，单核细胞，NK细胞，DC，B细胞和T细胞的亚群分布在不同分期没有显著差别。此外，巨噬细胞和T细胞的PD-1和PD-L1的表达水平在TNM各个时期比较稳定，表明免疫调节策略可能有利于早期肿瘤的治疗。
参考文献：
[1] Yonit Lavin, Soma Kobayashi, Andrew Leader, et, al. Innate Immune Landscape in Early Lung Adenocarcinoma by Paired Single-Cell Analyses[J].Cell, 2017,169(4): 750–765.
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