在细胞周期 S 期，复制后的 DNA 必须利用旧的组蛋白 （parental histones）和新生的组蛋白（newly synthesized histones）组装成核小体，这个过程是与 DNA 复制紧密耦联的，因此命名为 DNA 复制耦联的核小体组装（DNA replication-coupled nucleosome assembly）。这个 DNA 复制耦联的过程受到多种组蛋白伴侣和组蛋白修饰酶的调控。近些年，通过对经典的组蛋白伴侣 CAF-1 的研究以及一些新分子的鉴定，使得我们对于新合成的 H3-H4 四聚体进行核小体组装的机制有了新的认识。此外，染色质复制的体外重组技术 （in vitro reconstitution of chromatin replication）也进一步阐明了旧的 H3-H4 的核小体组装的机制。最后，近期的研究表明，在多细胞生物中 DNA 复制耦联的核小体组装对于细胞命运决定和维持非常重要。
前言：核小体作为表观遗传信息的载体
在真核细胞中，染色质结构控制一系列的细胞过程，包括DNA复制和基因转录。147bp 的 DNA 缠绕在组蛋白八聚体 （包含一个 H3-H4 四聚体和两个 H2A-H2B 二聚体）上构成染色质的基本单元核小体。组蛋白可进行翻译后修饰，这些修饰可以标记不同的染色质结构域（chromatin domains）并影响 DNA 代谢相关的过程 （processes related to DNA metabolism）。近期，在线虫和酵母中的一些研究表明，一些组蛋白标签 （包括 H3K27me3 和 H3K9me3）都是可以遗传的。此外，在人类细胞中，组蛋白修饰酶和组蛋白本身的突变可引起染色质状态的改变，进而诱发肿瘤。因此理解在有丝分裂过程中染色质状态遗传的机制具有重大意义。
图 1. 组蛋白八聚体的结构
https://www.extremetech.com/extreme/213582-new-findings-shed-light-on-fundamental-process-of-dna-repair
DNA 复制耦联的核小体组装将核小体形成和正在进行中的 DNA 复制联系起来，而它可能是表观遗传信息传递的第一步。近期的研究鉴定了参与 DNA 复制耦联的核小体组装的新因子，进一步阐明了DNA复制耦联的核小体组装的机制。此外，参与该过程的因子的突变，会影响细胞命运决定的维持。在这篇综述中，作者讨论了 DNA 复制耦联的核小体组装机制的最新进展，及其在细胞身份决定和分化过程中的作用。
1. DNA 复制耦联的核小体组装概述
DNA 复制以后，在新生 DNA 链上立即发生核小体重组。DNA 复制和核小体重组是紧密相连的：复制叉的速度依赖于新生组蛋白的供给情况以及核小体组装的效率。核小体的重组看起来很简单，但是实际上为组蛋白修饰传递给子细胞制造了很多挑战，因此需要精密的调控。
首先，双链 DNA 的复制需要新生组蛋白的额外供给，这些新生的组蛋白所携带的修饰与成熟染色质的不同结构域中的修饰差异很大。因此，旧的组蛋白修饰需要被复制到新生的组蛋白上。
第二，组蛋白修饰是通过“书写子（writer）”写上去的，通过“擦除子（eraser）”擦除的。Eraser 的出现会让组蛋白修饰稳定遗传给子细胞的过程变得错综复杂，比如在粟酒裂殖酵母中，在缺少 H3K9me3 eraser的情况下，H3K9me3 的遗传不依赖于 DNA 序列；但是在有 H3K9me3 eraser 的情况下，就需要特定的 DNA 序列来招募足够的 H3K9me3 writer。
最后，在人类和其他物种中，在正在复制的 DNA 上旧的和新生的 (H3-H4)2 四聚体可以形成不同的核小体，而且是被随机地分配到前导链和后随链上。旧的和新生的 (H3-H4)2 四聚体这种随机分配的特性使得区分包含旧的 H3-H4 的核小体和包含新的 H3-H4 的核小体变得非常必要，因为只有这样才能保证将旧的核小体中的标签复制到新的核小体上，但是这又进一步增加了亲代组蛋白修饰传递给子细胞的复杂性。下面，我们将分两个小节，详细讨论旧的和新生 H3-H4 的核小体组装过程中的最新进展（虽然有一些因子同时参与这两个过程）。
2. 新生核小体组装的调控
Regulation of De Novo Nucleosome Assembly
2.1 New Insights into Old Players
在细胞周期 S 期，新合成的组蛋白 H3-H4 必须从细胞浆中转移到细胞核中以重组核小体。一些组蛋白伴侣有助于组蛋白的折叠，阻止其与 DNA 过早的聚集。在这篇综述中，我们将主要讨论组蛋白伴侣 Asf1（anti-silencing function 1）与 H3-H4 二聚体结合后的下游事件。
Asf1 是一种高度保守的组蛋白伴侣，通过 H3 的表面结合 H3-H4，而 H3 的表面对于 H3-H4 四聚体的形成非常关键，因此 Asf1 与 H3-H4 二聚体形成复合物之后，可以阻断 H3-H4 四聚体的形成。在芽殖酵母中，Asf1 对于 H3K56ac 非常关键，H3K56ac 主要出现在新生的组蛋白 H3 上。因此，推测 Asf1-H3-H4 的复合物可作为 H3K56 组蛋白乙酰基转移酶 Rtt109 的底物。H3K56ac 促进 H3-H4 二聚体与 E3 泛素连接酶 Rtt101/Mms1 的相互作用；Rtt101/Mms1 可以泛素化 H3 的 C-端尾巴，包括 H3K122。这造成了 Asf1-H3-H4 复合物的不稳定，有助于将组蛋白二聚体转交给下游的组蛋白伴侣 CAF-1 和 Rtt106（图2）。此外，在芽殖酵母中，H3K56ac 也可以增强 CAF-1 和 Rtt106 的亲和性，因此促进了核小体的组装和基因组的稳定性。在人类中，只有一小部分新合成的 H3 包含这种修饰，而且并不像酵母细胞中 H3K56ac 扮演同样关键的角色，虽然在人类细胞中， Cul/DDB1 催化的 H3K122 的泛素化也可以负向调控 Asf1-H3 的相互作用，以将 H3-H4 从 Asf1 交接至下游的伴侣，包括 CAF-1。然而，H3K56ac 和 H3K122ub 如何影响组蛋白和其伴侣的结合还需要进一步证实。
图 2. DNA复制叉处的核小体组装
在酵母中，保守的组蛋白伴侣 CAF-1（chromatin assembly factor 1）包含 Cac1、Cac2 和 Cac3 亚基；在人类中，CAF-1 的亚基为 p150、p60 和 p48。CAF-1通过与“滑动的夹子（sliding-clamp）” PCNA 相互作用，而被招募到复制叉。CAF-1 结合 DNA 的能力对它在复制叉上的稳定性以及 H3-H4 四聚体的组装有什么作用，近期的研究提供了一些线索。在体外实验中，Cac1 亚基负责与 H3-H4 四聚体结合，作为复合物的支架。在酵母和人类细胞中，CAF-1最大的亚基包含一个有翼的螺旋域（winged helix domain，WHD），WHD 对于芽殖酵母 CAF-1 以一种非序列依赖性的方式结合到 DNA 是必须的。WHD 中的突变与 Cac1 的 PCNA-结合基序中的突变一起导致，在 S 期 CAF-1 与复制叉的接触更少。因此，CAF-1 结合到 PCNA 的能力以及结合到 DNA 的能力对于将 CAF-1 稳定到复制叉以进行核小体组装是十分关键的。
图 3. CAF-1 介导的 H3-H4 四聚体形成
Mattiroli F, Gu Y, et al. Elife. 2017 Mar 18;6.
通过一系列的体外实验，一些研究组已经揭示了在这个过程中 CAF-1 的 DNA 结合能力的功能。一个 CAF-1 异三聚体（CAF-1 与 H3-H4 二聚体）结合到一个 H3-H4 二聚体，这引起了一个构象变化，并将 Cac1 的 WHD 结构域打开，进而触发 CAF-1 的 DNA 结合活性；进一步与 DNA 结合，促进了包含 CAF-1 和两个 H3-H4 二聚体的复合物的形成。因此，CAF-1 二聚体化有助于 H3-H4 四聚体的形成，进而有助于核小体的形成，这与此前发现的人类 CAF-1 复合物对于核小体组装非常重要的现象是一致的。有趣的是，一旦组蛋白发生了影响四聚体形成的突变，它将不能从 CAF-1 释放，WHD 结构域也与 H3 的 N 端尾巴相互作用。这些结果说明，CAF-1 介导的 H3-H4 四聚体的放置需要 DNA 结合活性的参与，以及 CAF-1 自身的二聚体化，以及 H3-H4 的四聚体化。这种协作提供了一种机制，保障了亲代的 H3-H4 和新合成的 H3-H4 四聚体形成不同的核小体。此前研究表明，在芽殖酵母中组蛋白伴侣 Rtt106 也包含 DNA 结合基序，这个基序的突变会影响 Rtt106 的功能。此外，Rtt106 也可以形成二聚体。因此，研究 Rtt106 是否采用相似的协同机制进行核小体组装和放置是十分有意思的课题。此外，未来的补充性研究和结构生物学研究，对于包含 CAF-1、组蛋白以及 DNA 的复合物，可能提供更多的关于 CAF-1 介导的核小体组装以及随后从 H3-H4 中释放组蛋白伴侣以组装成四聚体（tetrasomes）的过程的见解。
2.2 New Players in the Old Puzzle
过去几年中涌现了有一些重要的发现，这些发现强调了从头核小体组装（de novo nucleosome assembly）过程中的新因子的功能。比如，在芽殖酵母中，FACT（facilitates chromatin transactions）蛋白参与新生 H3-H4 的核小体组装。组蛋白伴侣复合物 FACT 包含 Spt16 和 SSRP1（在酵母中为 Pob3），能与四种经典的组蛋白结合。FACT 通过与 H2A-H2B 相互作用而部分参与核小体重组，尤其是在转录和 DNA 复制中发挥重要作用。利用 spt16-m 突变的等位基因，一个 DNA 复制存在缺陷而其转录没有缺陷的部分功能分离的突变体（partial separation-of-function mutant），研究者发现 FACT 与 CAF-1 和 Rtt106 一起参与核小体组装。在生物化学角度，新生的 H3-H4 从 Rtt106 移交到 FACT，而 H3K56ac 可促进这种移交。在遗传学上，spt16-m 突变的等位基因与缺少 CAF-1 或 Rtt106 的突变体显示出合成缺陷（synthetic defects）。因此，在芽殖酵母中，CAF-1、Rtt106、FACT 功能冗余地或者协作负责新生 H3-H4 组蛋白放置到新生 DNA 中。
图 4. FACT 介导的新生核小体组装
Tsunaka Y, et al. Genes Dev. 2016 Mar 15;30(6):673-86.
近期，单链 DNA 结合蛋白 RPA（replication factor A）同时参与新生 H3-H4 的 DNA 复制耦联的核小体组装以及不依赖于 DNA 复制的核小体组装。在酵母中，RPA 包含 Rfa1、Rfa2 和 Rfa3 三个亚基；在人类中，RPA 的三个亚基为 RPA1、RPA2、RPA3。RPA 可覆盖在在 DNA 复制和修复过程中产生的 ssDNA 上。RPA 对于这些过程非常关键。在芽殖酵母中，RPA 结合 H3-H4，以及三个已知参与新生 H3-H4 的核小体组装的组蛋白伴侣 CAF-1、FACT、Rtt106。存在 H3-H4 结合缺陷的 rfa1 突变体其新生 H3-H4 核小体组装受到影响。体外实验中，RPA 结合 ssDNA，促进邻近双链 DNA 上 H3-H4 的核小体组装。基于这些结果，作者认为 RPA 为组蛋白伴侣和 H3-H4 在邻近新生 DNA 上的组装提供了结合平台。在人类细胞中，RPA 也被发现与 H3.1（在 DNA 复制耦联的核小体组装中 H3.1 被组装进入核小体）共纯化（共纯化即表示存在相互作用）。因此，很容易推测人类的 RPA 可能同样有助于DNA复制耦联的核小体组装。此外，在基因调控元件上放置 H3.3 的过程中，也发现人类 RPA 与组蛋白伴侣 HIRA 相互作用。基因调控元件富集在 R-loop 区域，RPA 结合 ssDNA 的能力对于 H3.3 的放置至关重要。基于这些结果推测，RPA 结合 R-loop 中的 ssDNA，可能在基因调控元件上促进 HIRA-介导的 H3.3 核小体组装。因此，RPA 复合物不仅在 DNA 复制耦联的核小体组装中，而且在不依赖于 DNA 复制的核小体组装中，都发挥作用。
此前，在 DNA 复制耦联的核小体组装中，H3.3 被发现具有填补缝隙的作用（gap-filling role）。研究 RPA-HIRA-H3.3 的放置通路是否参与这个过程将会十分有意思。然而，在 S 期，在所有的 DNA 复制叉中 RPA 结合 ssDNA，而且相比于 H3.3 核小体的组装，H3.1 核小体组装占主导地位。因此，在 S 期，如果 RPA-HIRA-H3.3 放置通路参与调补缝隙的作用，这个通路可能受限于促进 CAF-1 介导的 H3.1 核小体组装。
体外实验表明，参与同源重组的 TONSL-MMS22L 复合物是一个新的组蛋白 H3.1 伴侣。借助定量质谱方法，发现 TONSL-MMS22L 复合物与 H3.1，以及与组蛋白伴侣 Asf1b 和复制性解旋酶 MCM 的三个亚基共纯化。而且还观察到活性复制解旋酶复合物CMG（Cdc45、MCM、GINS）的关键组分 Cdc45 和 GINS 并不与 TONSL-MMS22L 相互作用，基于这些结果和现象推测，TONSL-MMS22L 可能与 MCM 解旋酶的非活性形式（inactive form）相互作用。在体外实验中，TONSL-MMS22L 复合物具有组蛋白伴侣活性，TONSL 的 N 端的锚蛋白重复域（ankyrin repeat domain，ARD）介导其与 H3-H4 的相互作用。对 ARD 与 Mcm2 组蛋白结合结构域（histone-binding domain，HBD）形成的复合物进行结构分析，发现 ARD 识别未甲基化的 H4K20（H4K20me0），H4K20me0 是新生 H4 的标志。TONSL 结合 H4K20me0 的能力对于 TONSL-MM2SSL 结合到复制叉非常重要。因此推测，除了作为 H3.1 的组蛋白伴侣，TONSL-MMS22L 还在标记包含 H4K20me0 的新生染色质中发挥作用。这些研究抛出了很多问题。首先，TONSL-MMS22L 为何更倾向于识别 H3.1，而不是 H3.3？其次，在正常 DNA 复制过程中，TONSL-MMS22L 复合物对于 H3.1 的核小体组装也发挥作用吗？第三，TONSL-MMS22L 复合物在核小体组装中的作用与它们在停滞的复制叉上进行同源重组的作用相关吗？
3. 旧的 H3-H4 的核小体组装
与新合成的 H3-H4 相比，旧的 H3-H4 四聚体组装进入核小体方面的机制还很不清楚。类似于新的 H3-H4 四聚体，可能的机制是，一旦复制体（replisome）前面的核小体被扰乱，组蛋白伴侣（其中一些直接参与DNA复制）就负责押解旧的组蛋白。如果没有一种将 DNA 复制叉前面的旧的 H3-H4 转移到邻近的正在复制中的 DNA 上的活性机制，那么旧的组蛋白就会扩散开，位点特异性的表观遗传信息也就丢失了。现阶段要鉴定参与旧的 H3-H4 核小体组装的蛋白以及阐明它们的功能，依然存在诸多挑战。令人欣慰的是，近期的研究已经鉴定了在这个过程中可能发挥作用的一些因子。
早期的体外研究显示，人类的 Mcm2（MCM 解旋酶复合物的亚基）包含一个可以结合 H3-H4 的 HBD。在芽殖酵母细胞中，这个结构域对于解旋酶活性并不是必须的，而且对于DNA复制的作用十分微弱的 Mcm2 中的 HBD 突变，可以导致转录沉默的缺陷，这提示了 HBD 在染色质功能中的重要性。如果 Mcm2 参与旧的 H3-H4 的放置，那么可能 Mcm2 与其他蛋白一起执行这种功能，因为酵母细胞表达组蛋白结合缺陷的 Mcm2 突变体是可存活的。
在人类细胞中发现，Asf1 可以与 MCM 解旋酶结合，这种结合由组蛋白 H3-H4 牵线搭桥。此外，与 MCM 解旋酶共纯化的 H3-H4 分子中存在一些在旧的组蛋白中出现的修饰。因此，这提示 Asf1 和 MCM 解旋酶在旧的组蛋白放置中发挥功能。近期的结构研究表明，Mcm2 可以与组蛋白 H3-H4 形成两种不同的复合物，两个 Mcm2 蛋白结合一个 H3-H4 四聚体，或者一个与 H3-H4 二聚体结合的 Mcm2 与 Asf1。当结合到四聚体时，Mcm2 阻断了 DNA 以及 H2A-H2B 中 H3-H4 的停靠位点，因此阻断了它们的核小体组装，这与早期的观察——旧的 H3-H4 在 DNA 复制以后保持四聚体——相吻合。但是作者和其他人提出了一个模型，即 Mcm2 捕获了被剥离出去的 H3-H4 四聚体，但是随后 Asf1 加入，Asf1 结合到 H3 表面（H3 表面参与 H3-H4 四聚体的形成）。在这个模型中，旧的 H3-H4 四聚体可能瞬时地解聚为两个二聚体。如上所述，在细胞周期的 S 期，旧的 H3-H4 四聚体作为一个整体被放置。因此，解聚旧的四聚体对于 DNA 复制后它们的重新组装是否必要，这件事情还有待考究。
近期，使用染色质作为模板，两个课题组利用在芽殖酵母中纯化的蛋白重构了染色质复制。在这个体外体系中，DNA 复制以后核小体可以被有效组装。此外，新合成的 H3-H4 并没有被加入到这个反应中。因此，这个体系可能包含了对于在 DNA 复制以后将旧的 H3-H4 四聚体转移到复制中的 DNA 上的最少组分，这提示旧的核小体的组装与新的核小体的组装是独立的。利用这套系统，研究发现 FACT 对于 DNA 合成是必须的，而两个组蛋白乙酰基转移酶 Gcn5 和 Esa1 也可以刺激 DNA 合成。此前研究发现， FACT 与 MCM 解旋酶共纯化，并被认为负责放置旧的组蛋白 H3-H4。在这个在染色质模板上重构的体外转录体系中，FACT 被认为扰乱核小体以促进基因转录。因此，是否 FACT 在体外 DNA 复制系统中的功能与它们在核小体重组、旧的 H3-H4 的放置或者两者兼具中的功能是否相关还有待进一步研究。
近期的研究发现，不同的染色质重塑复合物利用不同的组蛋白修饰来决定底物的偏好性。此外，染色质重塑复合物在DNA复制中具有不同的功能。因此，在 DNA 复制过程中，有可能 Gcn5 和 Esa1 修饰亲代的组蛋白以引导染色质重塑。在芽殖酵母中，Gcn5 被证明乙酰化 H3 N 端的赖氨酸残基，以及在新合成的 H3-H4 的 DNA 复制耦联的核小体重组过程中发挥作用。因此，可能类似于 FACT，Gcn5 在旧的和新生的 H3-H4 核小体重组中都发挥作用。总体而言，参与旧的 H3-H4 四聚体的核小体组装中的一些关键因子已经被鉴定出来。未来的研究将阐明它们是否确实参与旧的 H3-H4 的转移，以及如果参与，利用体内和/或位点特异性的突变，进一步阐明具体的机制。更进一步，复制体（replisome）组分对于旧的 H3-H4 的核小体组装是否需要，以及旧的 H3-H4 在何种程度上协同新合成的 H3-H4 的从头的核小体组装。
4. DNA 复制后染色质成熟：核小体回原位
Chromatin Maturation Following DNA Replication: Keeping Nucleosomes in Their Place
核小体组装以后，最开始随机放置的核小体之后被移动到原始的 DNA 位置，这个过程被称为“染色质成熟（chromatin maturation）”。无论在酵母和人类细胞中，在通过复制叉以后，重建核小体位置（re-establish nucleosome positions）所需要的时间根据基因的区域而变化。在芽殖酵母细胞中，启动子区域（核小体剥离区域（the nucleosome-free region, NFR），转录起始位点的正上方）特有的核小体结构在DNA复制后的数分钟复制。
在芽殖酵母中，有两个模型解释NFR的快速恢复。首先，转录因子和染色质重塑复合物快速结合到新生 DNA 并作为核小体放置的参考点（reference point）。另一种机制，染色质重塑因子与组蛋白伴侣合作，一起在正确的位置放置核小体。与芽殖酵母中的相反，在果蝇晚期胚胎中观察到的核小体位置呈现一种不同的动态。DNA 复制以后，启动子和增强子等调控元件丢失它们特有的 NFR 特征，直到通过复制叉一个小时以后才恢复。NFR 的恢复与转录因子的结合以及染色质重塑复合物（可能引导新放置的核小体回到原来的位置）相关。作者认为，这种更慢的成熟迫使转录因子与核小体竞争性地与DNA结合。这种机制也可能为染色质状态和基因转录提供一个机会窗口（provides a window of opportunity）。
图 5. DNA 复制后染色质成熟
然而，对于早期胚胎中的细胞，染色质可及性模式的重建在 DNA 复制后数分钟观察到。这提示在果蝇中，复制叉的通过之后染色质成熟可能依赖于发育阶段。与NFR区域不同，在芽殖酵母中，基因体（gene body）的核小体模式（nucleosome landscape）显示出更低的和变化的成熟速率。高度转录的基因在 DNA 复制后显示出更快的成熟速率，提示在核小体模式的重建中更快的染色质成熟对于转录发挥活性作用。此外，参与不依赖于 DNA 复制的核小体组装的 HIR 复合物，对于在活性基因中观察到的更快的染色质成熟也是需要的。特别地，一些基因的两个拷贝显示出不同的成熟速率，当转录的模板是新合成的 DNA 链时，无论在前导链还是后随链，成熟速率总是更慢。因为这与转录的方向一致，更慢成熟的拷贝从前进中的复制叉的反方向转录，作者认为存在一种可能抑制从这个基因拷贝转录的机制，进而避免复制和转录机器的冲突。
在不同染色质区域除了核小体成熟呈现不同动态，在 DNA 复制后，不同组蛋白修饰也以不同的速率恢复。借助质谱对 DNA 复制后多种在新合成的和成熟的染色质中的不同组蛋白修饰进行分析，发现在细胞进入下一个 S 期之前，绝大多数组蛋白翻译后修饰的总体水平被恢复（图 5）。有趣的是，观察到新生的 H3 上的组蛋白标签的两种不同的恢复模式：一些组蛋白标签从旧的组蛋白有效地复制到新生组蛋白，然而其他的标签需要数代（several generations）来使得新合成的 H3 上的修饰达到旧的 H3 上修饰的水平。比如，在下一个细胞周期之前，单甲基化标签对于新生组蛋白是必须的；而三甲基化，比如 H3K9me3 和 H3K27me3，则需要更久来恢复，而且需要新生的和旧的组蛋白上持续不断的修饰。以上的结果强调了DNA复制后染色质状态恢复的动态以及内容依赖性（context-dependent）的特性。
5. DNA 复制耦联的核小体重塑在细胞命运决定及维持中的功能
在一个更为简单的真核系统中，包括芽殖酵母和果蝇，对于 DNA 复制耦联的核小体组装必须的因子（包括 CAF-1 和 PCNA）的突变可减少转录沉默。推测这些因子对于沉默的染色质状态的遗传非常重要。在多细胞生物中，一种特定细胞类型的分化状态通过一种特异性的转录程序稳定。染色质结构和组蛋白翻译后修饰在这个过程中发挥重要作用。因此，在每种细胞的染色质中蕴藏的表观遗传信息的忠实传递有助于在细胞分裂过程中维持基因表达模式。近期在多个系统中的研究发现，核小体组装缺陷可以影响细胞身份和分化。
科学家们构建了一套筛选体系，一旦某个蛋白缺失，就可以增加小鼠成纤维细胞被转录因子 Oct4 重编程到诱导多能性干细胞（iPSC）的效率，在这种筛选中，作用最显著的因子是 CAF-1 复合物亚基。作者发现，CAF-1 复合物水平的降低加速了从不同分化程度的细胞类型重编程为 iPSC 的形成。CAF-1 的缺失增加了增强子元件区域染色质的开放性，否则这些区域对于转录因子来说是接触不到的，这促进了细胞的重编程。另一项独立的研究也发现，CAF-1 抑制全能性细胞（就像二细胞期的卵裂球一样）的出现。在小鼠中，只有合子和二细胞期的卵裂球具有全能性（可以生成整个胚外谱系），这种特性在多能性干细胞中丢失，显示出相对较弱的细胞可塑性。然而，CAF-1 介导的（通过缺失或者通过表达存在染色质重塑存在缺陷突变体）核小体活性受损导致一些多能性干细胞逆转到二细胞状态。缺失 CAF-1 导致染色质可及性的变化，诱导了全能性标签的表达。在缺失CAF-1的细胞中，染色质可及性增加，可能为转录因子和染色质调控因子提供了重置染色质状态的机会。这些研究表明，CAF-1可以作为细胞身份的看门者，在细胞分裂中通过维持染色质模式（chromatin patterns），因此维持细胞特异性的转录程序。早期的研究表明，在 DNA 复制过程中，CAF-1 复合物与异染色质蛋白 HP1 相互作用，这提示存在一种组蛋白伴侣调控异染色质标签 H3K9me3 传播的机制。
一项独立的研究报道，CAF-1 对于抑制性标志 H3K27me3 的传递以及对植物中负责干细胞激活的基因的沉默至关重要。CAF-1 可与 H3K27me3 甲基转移酶 PRC2 相互作用，因此推测 CAF-1 招募 PRC2 到 DNA 复制叉，进而将 H3K27me3 标志从旧的 H3 复制到新生的 H3。在分化的植物细胞中，这种复制耦联的H3K27me3的恢复与成年人类细胞中观察到的这种沉默性的标签的慢速传播形成对比。在哺乳动物细胞中，CAF-1 是否在组蛋白甲基转移酶参与的 H3K27me3 的传递中发挥活性作用还有待进一步的验证。但显而易见的是，组蛋白伴侣 Asf1 也参与细胞命运的维持和决定。在卵子中，Asf1a 被鉴定为重编程因子，对于将人类成年皮肤成纤维细胞重编程到 iPSC 是必要的。在这个过程中，Asf1a 的工作机制还有待阐明。
在一些情况下，干细胞经历不对称分裂，产生一个干细胞和一个分化的细胞。参与 DNA 复制耦联的核小体组装的因子也可能在不对称细胞分裂中发挥作用。比如，在线虫中，影响 DNA 复制耦联的核小体组装的突变，包括 H3 四聚体界面的突变和 CAF-1 的缺失，剥削了对于神经双边不对称（neural bilateral asymmetry）形成所必要的不对称分裂。作者认为这种不对称分裂可能归因于前导链和后随链中核小体的差异性放置。 PCNA 富集在后随链，这可能偏向于 CAF-1 介导的核小体放置，产生具有不同核小体密度（这可能会影响对子细胞中神经元命运必须的基因的表达）的姐妹染色单体。在果蝇的生殖干细胞中也观察到不对称的组蛋白分离，产生一个富集旧的组蛋白 H3.1 的干细胞，和一个富集新合成的 H3.1 的分化的促性腺细胞（gonialblast）。相反，H3.3 以不依赖于 DNA 复制的方式被组装进核小体，而 H3.3 并没有显示出这种不对称的分离模式。这些结果表明，复制耦联的核小体组装通路可能在这种一个干细胞和一个分化细胞之间的剧烈的组蛋白不对称分布中发挥作用。
6. 结语
在过去 25 年中，参与 DNA 复制耦联的核小体组装的典型的组蛋白伴侣 CAF-1 的发现，加速了我们理解这个重要的细胞过程的进度。近些年具有不同功能的多种蛋白加入了调控 DNA 复制耦联的核小体组装的因子的名单。越来越明显的是，DNA 复制和核小体组装的联系如此紧密，一些参与DNA合成的蛋白，比如 Mcm2 和 RPA，在核小体组装中也具有直接和相对独立的功能。组蛋白伴侣复合物的结构生物学研究揭示了新的结合模块，以及这些蛋白与它们所运输的货物（cargo）之间的相互作用，为阐明组蛋白运输和放置（histone shuttling and deposition）的分子机制提供了线索。此外，借助重组的染色质复制的体外研究也被证明是一个研究核小体组装的宝贵工具。与调控新生组蛋白的核小体组装的组蛋白伴侣的复杂网络相反，掌控旧的组蛋白（携带表观遗传信息）的转移的具体机制始终还不清楚（参见「悬而未决的问题」）。要回答这个或其他与DNA复制耦联的核小体组装相关的基本问题，一个核心挑战是检测这个过程的技术困难。随着新技术的发展，包括冷冻电镜（适用于鉴定大的复合物的结构）以及 eSPAN 方法（检测全基因组水平 DNA 复制叉上前导链和后随链上的蛋白），以及具有潜力的单分子技术，我们期待获得关于核小体组装过程的新认知。最后，随着基因编辑技术的发展，如可精确编辑基因的 CRISPR/Cas9，我们也期待进一步探究在多细胞生物的细胞分化和发育中 DNA 复制耦联的核小体组装的功能。
悬而未决的问题：
Outstanding Questions：
1. When does tetramerization of H3–H4 dimers occur when bound to different histone chaperones?
2. How is a histone chaperone released from histones for nucleosome formation?
3. Which factors are responsible for parental H3–H4 deposition onto replicating DNA?
4. In view of the fact that FACT is involved in nucleosome disassembly and reassembly, could this histone chaperone escort parental histones during the process of histone recycling?
5. Is nucleosome assembly regulated distinctly at leading and lagging strands of DNA replication forks?
6. What are the exact roles of transcription factors and chromatin remodelers in replication-coupled nucleosome assembly?
7. Does transient loss of the nucleosome landscape have any biological meaning in the maintenance of cell identity during division?
8. How, and to what extent, does DNA replication-coupled nucleosome assembly regulate cell fate and differentiation? Do factors responsible for distinct steps of nucleosome assembly have different roles in cell identity maintenance and differentiation? What are the implications of deregulation of these mechanisms in diseases such as cancer?
9. Is the nucleosome assembly machinery involved in the asymmetric cell divisions that give rise to two distinct daughter cells? How common is this mode of histone segregation in multicellular organisms?
10. Are the different histone marks transmitted with distinctive fidelity? How are they re-established after mitosis?
本文译自 2018 年 2 月发表于 Trends in Biochemical Sciences 上题为 Replication-Coupled Nucleosome Assembly in the Passage of Epigenetic Information and Cell Identity 的综述文章，文章一作为 Albert Serra-Cardona，通讯作者为哥伦比亚大学 Zhiguo Zhang（张志国）教授。
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