Nature：CRISPR文库筛选影响PD-1抗体治疗效果的靶分子

强强联手，才能冲击高分文章！

 

虽说以 PD-1免疫检查点抑制剂为代表的免疫肿瘤治疗方案，可为患者带来新的希望，但实际上临床的患者对PD-1抗体有应答的比例并不算高（大约20%）。

为了深入挖掘PD-1抗体耐药的具体机制，W. Nicholas Haining研究小组通过体内CRISPR库，筛选了多个影响PD-1抗体治疗效果的基因，相关成果接连发表在2017年7月和2018年12月《Nature》上，就让我们看看他们的研究思路。（回复“181224”，可下载文献）

建立体内CRISPR库

研究者在Cas9稳定表达的B16黑色素瘤细胞中以慢病毒感染的方式转入9872个sgRNAs，靶向2368个肿瘤细胞中表达较高的基因，构建基因编辑的B16细胞库，接种于小鼠皮下。

B16细胞在T细胞缺陷小鼠（TCR敲除）、瘤苗GVAX免疫的野生小鼠，或GVAX+PD-1抗体处理小鼠上生长快慢不同。

接种12-14天后取皮下肿瘤，分析在获得性免疫压力下肿瘤库中靶基因的富集或减少，即免疫治疗的压力下优势生长的克隆会扩增，肿瘤内其sgRNA转基因会富集，而劣势生长的克隆，肿瘤中其sgRNA转基因会减少。

图1 建立B16细胞的体内Crispr库

验证候选分子

作者采用体内竞争实验的方法验证候选靶基因的作用。转导对照sgRNA的B16细胞表达红色荧光蛋白，转导候选基因sgRNA的B16细胞表达GFP蛋白，两者按一定比例混合接种于小鼠皮下，12-14天后FACS分析GFP的比例。

比例增高提示敲除该基因导致PD-1抗体治疗的耐药，比例降低提示敲除该基因后增强PD-1抗体的治疗效果。

通过这种方案，作者较深入研究了两个基因，PTPN2和ADAR1（产出两篇Nature）。

图2 体内竞争实验验证候选基因的作用

图3 PTPN22和ADAR1缺失增强PD-1抗体的抗肿瘤效果

深入研究候选分子对肿瘤的作用机理

确定了候选分子，接着就是对选定的候选分子进行深入研究，我们以ADAR1为例。

1）组织细胞水平的研究：

作者通过免疫组化染色发现ADAR1缺失导致B16肿瘤中浸润的CD8+T细胞明显增加，FACS分析肿瘤浸润的免疫细胞发现多种抗肿瘤的的免疫细胞明显增多，免疫抑制细胞减少，如CD8+T细胞、NK细胞增多，MDSC、TAN减少。

通过单细胞RNA-seq对浸润的免疫细胞进行功能分类，进一步确认ADAR1缺失导致抗肿瘤免疫增强。

图4 ADAR1缺失增强抗肿瘤免疫

2） 信号通路水平：

对RNA-seq结果分析发现肿瘤内浸润的免疫细胞ADAR1缺失组其IFN应答基因表达升高，肿瘤裂解物中IFN因子水平亦升高。

图5 ADAR1缺失增强肿瘤微环境中IFN信号

体外细胞培养实验发现，IFN处理B16肿瘤细胞，发现IFN因子导致ADAR1缺失B16细胞凋亡显著提高。

体内荷瘤实验亦发现IFN信号受体缺失或者IFN下游转录因子STAT1缺失削弱了ADAR1缺失的抗肿瘤效果。

射线照射能提高IFN的表达，研究发现射线照射亦能协同ADAR1缺失增强PD-1抗体的治疗效果。这些结果提示ADAR1缺失是通过IFN信号来发挥抗肿瘤效应的。

图6 ADAR1缺失通过IFN信号发挥抗肿瘤作用

ADAR1是RNA编辑酶，催化腺苷酸向次黄嘌呤苷酸转化，抑制双链RNA形成，从而抑制IFN信号的抗病毒免疫反应。

研究发现ADAR1缺失导致细胞内DsRNA升高，通过其感应分子PKR和MDA5增强免疫应答、抑制肿瘤生长。

图7 ADAR1缺失通过PKR和MDA5发挥抗肿瘤作用

荷叶感悟

无论是写文章还是写标书，荷叶觉得可以参考学习W. Nicholas Haining的研究，例如：

1）你的研究是否是热点？本文研究的就是明星分子的关键问题，PD-1抗体无效或耐药问题。

2）是否用到了前沿技术？如本文采用CRISPR技术建库、单细胞RNA测序等。

3）你的生物信息学用的怎么样？你的各种大数据能否“花式”展示？

4）当然还有必不可少的完整的研究套路。

5）此外，荷叶觉得建立自己的科研“软平台”十分必要。比如说这两篇文章作者建立的体内CRISPR库，会筛选获得一大批候选分子，如果选定的分子能深入研究发表在较好的期刊上，那么其后续其他候选分子的研究也会顺利很多，不仅会研究的比较深而且也便于研究生的培养和基金的申请。

参考文献：

1. Ishizuka JJ, et al. Loss of ADAR1 in tumours overcomes resistance to immune checkpoint blockade.Nature. 2018 Dec 17.

2. Manguso RT, et al. In vivo CRISPR screening identifies Ptpn2 as a cancer immunotherapy target.

Nature. 2017 Jul 27;547(7664):413-418.