一个神奇的FFPE样本建库神器之RNA篇

SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit v2- Pico Input Mammalian

Formalin Fixed and Paraffin Embedded

FFPE最早主要是用于病理形态学的观察。随着NGS技术的快速发展，从FFPE样本中分离纯化核酸进行后续的研究逐渐成为重要手段。

但是，FFPE-RNA测序无疑是“难于上青天”的存在。首先，在FFPE样本处理和储存过程中，很容易发生核酸的降解和损伤，而且RNA相比DNA更易降解。再者，众所周知，完整的RNA分子含量非常有限，总RNA样本中约90%都是核糖体RNA（rRNA）序列，所以从有限且珍贵的材料中获得完整且准确的信息有很大的难度。

所以，

如果恰好做转录组的测序，如果恰好是FFPE来源样本，如果恰好有以上困惑，

那么，这个神器值得拥有

【SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit v2- Pico Input Mammalian】

“离经叛道”的rRNA去除模式

FFPE样本珍贵，担心从总RNA中去除rRNA，会造成纯化后的起始样品太少？选择它吧，不按套路出牌的SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit v2- Pico Input Mammalian（以下简称SMARTer Pico v2），特别的黑科技Zap R v2& R-Probes核糖体cDNA去除技术，可以实现不需要前处理（去除核糖体RNA），带来不一样的操作体验！

技术概要：

(以上图片来源于Takara Bio Inc.)

“难以置信”的RNA品质包容度

FFPE样本降解严重，害怕不能得到高质量文库？选择它吧，专为低质量样本设计的，可以FFPE样本中提取的的total RNA起始，6小时内制备具有方向性的文库！完美支持FFPE RNA（DV 200> 25％）获得高品质的文库！

Tips:

DV 200指的是一种评价RNA质量的指标，即长度超过200 nt的RNA片段在所有RNA序列中的比例。RNA的质量越高，DV200值越高。

Takara分别测试了DV200在28%-68%之间的4个FFPE RNA样本，以10 ng起始使用SMARTer Pico v2试剂盒进行文库构建。通过对样本的评估发现，无论RNA质量如何，都可以生成高质量的文库，且基本都无接头二聚体的扩增产物产生。即使DV200低于30%（RNA样本高度降解），也能表现出较高的文库得率！

(以上数据来源于Takara Bio Inc.)

“事实说话”-用户实例分享

听了这么多，还是担心是“王婆卖瓜，自卖自夸“。选择它吧，相信我，用事实说话的，不仅仅有某著名访谈，还有SMARTer Pico v2！不仅仅有Takara严谨的数据评测，还有实力用户的真实反馈加持！

臻和（北京）科技有限公司的研发团队：

取3个不同降解程度的FFPE-RNA样本---A，B和C样本（DV200在11%-80%之间）, 使用SMARTer Pico v2试剂盒制备文库，然后进行NGS分析。其中B样本分别以10 ng和50 ng起始，其他A、C样本均以50 ng起始。

从结果可以看出，不论FFPE-RNA的品质和起始量的高低如何，都有相当高的转录本检测数（当FPKM≥1时，转录本数均大于10,000），而且不同样本之间的一致性也非常高！其中同一样本（B样本）的不同起始量之间，即使是特别低的10 ng起始量，也显示出与50 ng起始量高度一致的数据结果！同时值得注意的是，C样本（DV200=11%,RIN=2.5）虽然高度降解，质量较差，但转录本检测数、Q20和Q30等关键性指标仍然非常出色！

这些数据都佐证了以降解样本起始时，使用该试剂盒可以得到高品质的文库！

Input amount A(50ng) B(50ng) B(10ng) C(50ng)

DV200（%） 75 80 80 11

RIN 7.5 2.1 2.1 2.5

Total reads 54,354,978 60,432,366 58,448,242 50,730,574

% duplicates 32.9 24.6 34 18.8

transcripts≥ 1 FPKM 11,510 11,698 11,730 10,450

transcripts≥ 0.1 FPKM 20,559 19,531 19,439 22,486

Q20(%) 97.54% 97.55% 97.56% 95.08%

Q30(%) 94.13% 93.92% 93.98% 90.66%

以上数据由臻和（北京）科技有限公司提供

所以，恰好你要用高度降解的FFPE样本进行转录组分析，恰好我有SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit v2- Pico Input Mammalian。虽然都说人间不值得，但你值得拥有它！

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