发表状况
CancerResearch 2018 March
摘要
癌细胞表现出高代谢活性，糖酵解和脂肪酸合成高度活跃,其合成主要通过细胞质柠檬酸盐代谢。细胞内柠檬酸盐主要来源三羧酸循环。本研究发现线粒体柠檬酸盐转运蛋白（pmCiC）的质膜特异性变体是癌细胞细胞外柠檬酸的运载体。代谢组学分析显示柠檬酸盐摄取通过柠檬酸盐依赖性代谢途径广泛影响癌细胞代谢。葡萄糖酸盐治疗能特异性地阻断pmCiC，减少的鼠异种移植物中的人胰腺癌肿瘤生长。pmCiC的高表达与许多人类癌症的侵袭和晚期肿瘤阶段相关。这些发现为细胞外柠檬酸盐转运作为癌症治疗的新潜在靶点提供证据。
方法、结果：
1.不同的细胞系（前列腺癌PC-3M、胰腺癌MiaPaCa-2、胃癌TMK-1VS 非肿瘤性的乳腺MCF10A 前列腺PNT2-C2细胞系）在200μM [U-13C] 柠檬酸孵育 24 h，比较细胞内标记13C与12C之间的比值，结果显示肿瘤细胞能在正常的生理条件下摄取细胞外柠檬酸，并且摄取量相对于非肿瘤细胞系多Fig1A
在不同条件下(24h常氧、24h常氧+谷氨酰胺剥夺、24h常氧+葡萄糖剥夺、72h常氧、72h缺氧、72h常氧+饥饿、72h缺氧+饥饿)生长的PC-3M细胞中细胞内标记13C与12C之间的比值的变化，结果显示癌细胞摄取细胞外柠檬酸，在葡萄糖剥夺24h摄取最多，可达到胞内总citrate的三分之一Fig1B
据文献报道，K+-dependent pmCiC 是肿瘤细胞的柠檬酸转运蛋白。在所有人胰腺癌细胞系(MiaPaCa-2, L3.6pl, HPAF-II and BxPC3）中均有表达。用siRNA 干扰后柠檬酸的摄取显著下降，说明K+-dependent pmCiC 是肿瘤细胞的柠檬酸转运蛋白，负责柠檬酸的摄取。Fig1C D
图1.肿瘤细胞通过pmCiC吸收细胞外柠檬酸盐。
（A）正常（乳腺MCF10A 前列腺PNT2-C2细胞系）和癌症（PC-3M前列腺癌，MiaPaCa-2-胰腺癌和TMK-1-胃癌）细胞系中细胞在含氧量正常的条件下，与200μM[ U-13C]柠檬酸盐，10mM葡萄糖和2mM谷氨酰胺孵育24小时检测13C6 / 12C柠檬酸盐比例（n = 3，除了MCF10A n = 6）， 对所有组进行单因素方差分析（P = 0.0003），然后正常与癌细胞进行双尾t检验（*** P <>
（B）在不同生长条件的PC-3M细胞中的细胞内13C6 / 12C柠檬酸盐。
（C）pmCiC在PNT2-C2和PC-3M细胞的总蛋白中的表达，其具有不同的蛋白载量(up)和PC-3M细胞和不同的人胰腺细胞系PDI作为对照（down）
(D) 瞬时转染siRNA的细胞pmcic的表达水平（右）以及柠檬酸的摄取情况（左; *** P <0.005，n =="">
2. 为探讨细胞外柠檬酸对肿瘤细胞代谢的影响，测定了细胞外柠檬酸对肿瘤细胞Krebs循环活性和糖酵解的影响。本研究采用液质联用技术，比较在同位素标记 [U-13C]葡萄糖/谷氨酰胺的情况下，柠檬酸盐缺乏条件下(透析血清)或添加200μM柠檬酸盐培养基培养的前列腺癌细胞内代谢物比值，结果显示常氧条件下，细胞外柠檬酸盐的存在和摄取减少了标记碳从葡萄糖到柠檬酸的掺入量Fig2A；缺氧条件下，细胞外柠檬酸盐的存在和摄取导致m+4柠檬酸含量有所下降Fig2C，证实添加了柠檬酸导致谷氨酰胺通过Krebs循环合成柠檬酸减少。这些结果表明细胞外柠檬酸能改变肿瘤细胞对葡萄糖和谷氨酰胺的利用。
Fig 2. 细胞外柠檬酸摄取改变了肿瘤细胞的代谢。PC-3M细胞用4mm[U-13C]葡萄糖孵育24h，加或不加2 0 0μM未标记柠檬酸。
（A）柠檬酸同位素标记比重(*P<>
（B）流式细胞术测定PC-3M(左)和pnt2-C2(中间)细胞ROS合成的差异。(*P<>
（C）谷氨酰胺代谢：PC-3M细胞在缺氧条件下与2mM13C标记的谷氨酰胺、25 mM未标记葡萄糖±200μM未标记柠檬酸孵育24h,检测柠檬酸同位素标记比重(*P<>
（D）PC-3M细胞在常氧(左)和缺氧(右)条件下，加或不加2 0 0μM柠檬酸盐培养24h的葡萄糖消耗量和乳酸释放量。(**P<><>
3. 研究了细胞外柠檬酸对细胞内游离氨基酸合成的影响。PC-3M细胞在加25 mm[U-13C]葡萄糖±200μM的培养基中培养。结果显示在常氧条件下，在细胞外柠檬酸盐存在下，标记葡萄糖与谷氨酸(α酮戊二酸衍生物)和鸟氨酸(谷氨酸是其前体)的13C掺入量显著减少。而脯氨酸（另一种谷氨酸衍生物）改变无统计学差异(图3A)。
Fig3.不同来源的癌细胞对细胞外柠檬酸的摄取。
(A) 细胞外柠檬酸对常氧条件下游离氨基酸同位素富集的影响。PC-3M细胞在添加[U-13C]葡萄糖的培养基中孵育72h。不含200μM未标记柠檬酸。(**P<><>
（B）细胞外柠檬酸对细胞内氨基酸水平的影响。将PC-3M细胞在低氧条件下在补充有[U-13C]葡萄糖的培养基中培养24小时，所述培养基含有或不含200μM未标记的柠檬酸盐。显示了游离氨基酸的同位素富集。
（C）用含有或不含200μM柠檬酸盐的25mM [U-13C]葡萄糖孵育24小时后（左）。未标记的细胞内柠檬酸盐降低;（中）人胰腺（L3.6pl）和胃（TMK-1）癌细胞系中的完全标记的细胞内柠檬酸盐增加（右）用含有或不含200μM柠檬酸盐的5.5mM [U-13C]葡萄糖孵育24小时后胰腺和胃癌细胞系中未标记的细胞内柠檬酸盐减少（** P <0.01，*** p=""><0.001; n="">
（D）将L3.6pl细胞与5.5mM [U-13C]葡萄糖一起孵育24小时，添加或不添加200μM未标记的柠檬酸盐，检测柠檬酸盐的同位素组分（* P <0.05; **="" p=""><0.01; n="">
4. 研究葡萄糖酸盐抑制柠檬酸摄取对肿瘤生长和体内代谢的影响。使用葡萄糖酸钠（i.p.）减小免疫缺陷小鼠皮下人胰腺（L3.6pl）肿瘤体积（图4A）。代谢组学分析对照组和葡萄糖酸盐处理组的肿瘤组织显示出显著不同的代谢特征（图4B和补充图S5A-D）。总之，体内发生的代谢改变支持了体外实验结果，即葡萄糖酸阻止了柠檬酸的内流，从而改变了柠檬酸向癌细胞的供应和代谢。
Fig4. 葡萄糖酸盐可减少肿瘤生长并改变癌组织的代谢特征。
（A）小鼠皮下注射人胰腺L3.6pl癌细胞。每天腹腔注射10毫克葡萄糖酸钠（100μl），肿瘤生长明显减少;对照组注射NaCl（100μl）。
（B）从小鼠中取出肿瘤并进行目标代谢物分析，然后进行通过OPLS-DA分析。
5. 为进一步揭示pmCiC与人类肿瘤的相关性，采用免疫组织化学方法检测pmCiC在不同组织中的表达。
Fig5. 癌细胞在原发性肿瘤和转移部位表达pmCiC。A，B，C和F中的组织用pmCiC特异性抗体染色。
（A）正常的前列腺组织，管腔周围的上皮细胞有显着染色，特别是它们的顶侧（箭头）。
（B）良性前列腺增生，其具有明显的前列腺上皮细胞染色（注意与正常组织相比更强的染色）
（C&D）pmCiC（C）或（D）组织切片来自相同癌腺同时进行p63和Racemase / P504S染色。褐色染色（在D中）表明正常细胞，p63阳性核和Racemase/ P504S细胞质染色阴性; 细胞质阳性Racemase / P504S（粉红色）和核阴性p63表示癌细胞。 黑色箭头显示相应的组织区域，以便于pmCiC与p63-Racemase / P504S染色之间的比较
（E&F）前列腺细胞的淋巴结转移：（E，10倍放大）HE染色前列腺癌转移的淋巴结和（F）用pmCiC免疫组化染色的相同组织。
6. 本研究还发现pmCiC染色强度与肿瘤分级之间存在相关性。(Fig. 6A-D)
Fig6 pmCiC在不同来源的癌组织中表达。
（A，B-胃癌）（A）所示具有不规则管状结构的胃腺癌，肠（腺）型，与弥漫型胃腺癌（B）相比，该亚型中的pmCiC染色是弱的，弥漫型胃腺癌（B）染色是局灶性的和斑片状的（主要是顶端的），几乎所有的印戒细胞都被pmCiC强烈染色。
（C，D-胰腺癌）:( C）中度分化的胰腺导管腺癌细胞在细胞质中染色异质性和弱阳性，而低分化（D）胰腺导管腺癌（*）是强阳性
Abstract
Glycolysis and fatty acid synthesis are highly active in cancer cells through cytosolic citrate metabolism, with intracellular citrate primarily derived from either glucose or glutamine via the tricarboxylic acid cycle. We show here that extracellular citrate is supplied to cancer cells through a plasma membrane-specific variant of the mitochondrial citrate transporter (pmCiC). Metabolomic analysis revealed that citrate uptake broadly affected cancer cell metabolism through citrate-dependent metabolic pathways. Treatment with gluconate specifically blocked pmCiC and decreased tumor growth in murine xenografts of human pancreatic cancer. This treatment altered metabolism within tumors, including fatty acid metabolism. High expression of pmCiC was associated with invasion and advanced tumor stage across many human cancers. These findings support the exploration of extracellular citrate transport as a novel potential target for cancer therapy.
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